El intercambio de regiones de proteínas estructuralmente similares para crear kimeras nos permite investigar la importancia de las regiones responsables de las funciones biológicas de la molécula a estudiar. La región intercambia la estructura secundaria general de la proteína para que la región sea importante para su estructura general se pueda distinguir de las que median directamente las funciones biológicas. Se puede convertir en seleccionar qué regiones exactas se reemplazarán.
Comenzar con intercambios más grandes suele ser útil para identificar la funcionalidad clave de la proteína. Para comenzar el procedimiento, seleccione una proteína adecuada como donante para intercambiar regiones con la proteína de interés como se detalla en el protocolo de texto. A continuación, obtenga las secuencias de aminoácidos proteicos del receptor y de las proteínas del donante de la base de datos de secuencias de referencia accediendo primero a la sección de genes en la página web ref seq.
Escriba el nombre de la proteína de interés en el cuadro de búsqueda y haga clic en Buscar. Haga clic en el nombre del gen de la especie deseada en la lista resultante. Desplácese hacia abajo hasta la sección ref seq para ver todas las isoformas documentadas.
Haga clic en el identificador de secuencia para la isoforma de interés. Desplácese hacia abajo y haga clic en cds para resaltar la región de codificación de proteínas del gen. En la parte inferior derecha de la pantalla, haga clic en FAFSDA y copie la secuencia genética.
Guarde la secuencia de ADN utilizando un software de edición de ADN adecuado. Cuando utilice el APE libremente disponible, abra el programa, pegue la secuencia copiada en el cuadro en blanco, seleccione el nombre de la secuencia y haga clic en Guardar. Ahora, elija las regiones proteicas que se sustituirán en las diferentes construcciones kimericas dividiendo primero la secuencia proteica de interés en distintas regiones estructurales.
Para ello, descargue los datos estructurales de la proteína de interés desde el sitio web de PDBe. Acceda a la página PDBe de la proteína y descargue el archivo PDBe haciendo clic en descargar en el lado derecho de la pantalla. Abra el archivo PDBe en un sistema de visualización molecular, como Pymol.
En Pymol, muestre la secuencia de nucleótidos, oculte los datos estructurales predeterminados y seleccione la vista de dibujos animados para visualizar claramente las características estructurales de la proteína. Haga clic en la secuencia de nucleótidos en la parte superior de la pantalla para resaltar diferentes partes de la molécula, observando los aminoácidos correspondientes a cada característica estructural distintiva. Ahora, anote las distintas regiones estructurales en la secuencia de ADN en APE abriendo la secuencia de ADN, seleccionándola y haciendo clic en ORF translate, luego haga clic en el último aminoácido de la primera región para resaltar su posición en la secuencia de ADN y seleccionar la codificación del nucleótido para esa región.
Haga clic con el botón derecho en la selección y seleccione una nueva función para darle un nombre y un color. Repita el proceso para cada región estructural identificada en el paso anterior. Para alinear las secuencias de residuos de las dos proteínas, primero, obtener las secuencias completas de aminoácidos de las proteínas donantes y receptoras en APE.
Como antes, abra la secuencia de ADN del donante, selecciónela y haga clic en ORF translate. Luego, acceda a la página web de Clustal Omega y luego coloque las secuencias de aminoácidos de las dos proteínas. Cada secuencia debe proceder por una línea de texto con el nombre de la proteína para ser identificada correctamente.
Desplázate hacia abajo y haz clic en Enviar. Recupere el archivo de alineación haciendo clic en la pestaña del archivo de alineación de descarga y guárdelo. Este archivo puede ser abierto por cualquier programa de edición de texto.
Utilizando el archivo de alineación como referencia, anote las regiones estructurales correspondientes de la proteína donante en su secuencia de ADN. Cree una copia de la secuencia de ADN anotada de la proteína receptora y cámbiele el nombre a una proteína kimerica. Abra la secuencia de ADN renombrada en APE.
Seleccione la región que se va a intercambiar en la proteína del donante y, a continuación, seleccione la región correspondiente en la proteína receptora renombrada. Pegue la secuencia de ADN de la proteína del donante y luego guarde los cambios. Diseñe las imprimaciones de terminal utilizando un editor de ADN como APE.
Cree un nuevo archivo de ADN, inicie la imprimación de terminal final con una secuencia de directriz. Seguido por el primer sitio de restricción seleccionado en los vectores MCS y el espaciador opcional en los 18 a 27 pares base iniciales del gen de interés. En el nuevo archivo dna, diseñe la secuencia de imprimación de terminal C para comenzar con los 18 a 27 pares base finales del gen de interés seguido de un espaciador opcional, el segundo sitio de restricción elegido y la secuencia de directriz.
Resalte toda la secuencia, haga clic con el botón derecho y seleccione el cumplido inverso para obtener la imprimación inversa. Ahora, diseñe imprimaciones para cada una de las regiones fronterizas en las construcciones kimericas. En la secuencia de ADN de la kimera, resalte una región de 30 pares base en la zona donde las secuencias originales e insertadas están en contacto.
Se compone de 15 pares base en cada secuencia. Copie la región y péguela en un nuevo archivo de ADN. Esta secuencia será la imprimación delantera.
Haga una copia de la imprimación de avance generada en el paso anterior y cámbiele el nombre como imprimación inversa. Resalte la secuencia de imprimación, haga clic con el botón derecho y seleccione complementar al revés para generar la secuencia de imprimación inversa. Repita estos pasos para cada zona de contacto en la secuencia de ADN kimerico.
Generalmente, se requieren dos conjuntos de imprimaciones inversas hacia adelante para generar una kimera, a menos que el reemplazo se produzca en las regiones del terminal N o C. Preparar una mezcla de reacción PCR individual para cada uno de los fragmentos que componen la proteína kimerica. En primer lugar, establezca un tubo de microfusión de un punto cinco mililitros sobre hielo y pipetee los diferentes reactivos de las mezclas de PCR en el orden indicado en el protocolo de texto.
Asegúrese de que se emplean las imprimaciones y plantillas correctas para cada reacción de PCR. Etiquete dos tubos PCR de punto cero de pared delgada dos mililitros para cada reacción y transfiera 20 microlitros de la mezcla de PCR correspondiente en cada tubo. Transfiera los tubos PCR a un termociclador PCR e inicie el protocolo como se detalla en el protocolo de texto.
Una vez completada la reacción pcR, añada cuatro microlitros de seis x tampón de carga de ADN en cada tubo. Inserte el gel de agaross del uno por ciento en una unidad de electroforesis y cúbralo con tampón TAE. Cargue cuidadosamente las muestras en el gel junto con un peso molecular.
Después de ejecutar el gel a 80 a 120 voltios durante 20 a 45 minutos, apague la unidad de electroforesis y retire el gel de agoross. Visualice las bandas de ADN amplificadas bajo la luz UV. Usando una cuchilla de afeitar, corte los fragmentos de ADN individuales del gel y transfieralos a dos tubos de microfusión mililitros etiquetados.
Después de utilizar un kit de limpieza de PCR para purificar los fragmentos de ADN, cuantifique la cantidad de ADN recuperado midiendo la absorbancia de las muestras a 260 nanómetros y 340 nanómetros en un espectrofetómetro. Ahora, realice la amplificación de PCR para generar la secuencia de ADN kimerico. En primer lugar, configure 50 microlitros de una reacción PCR para fusionar los componentes separados de la kimera como antes.
Emplear las imprimaciones terminales N y C junto con 10 nanogramos de cada uno de los fragmentos de ADN amplificados. Recuperar y cuantificar el fragmento de ADN purificado como antes, en 30 microlitros de agua libre de núcleo. Este fragmento contiene la secuencia de ADN kimerico flanqueada por los sitios de restricción incluidos en las imprimaciones terminales.
La generación de una proteína kimerica se ejemplifica con dos miembros de la familia inter luke y seis de sitokina. Oncostaten M en factor inhibidor de la leucemia. La kimera de elevación OSM resulta del intercambio de la región de bucle BC de OSM con una secuencia de elevación correspondiente.
El primer paso de amplificación de PCR consistió en tres reacciones separadas. El fragmento de OSM de terminal N, que requería imprimaciones inversas de inicio N-terminal OSM hacia adelante y BC utilizaban OSM como plantilla. El bucle LIF BC se obtuvo a través de BC start forward y BC N reverse primers usando LIF como plantilla.
El fragmento C-terminal OSM utilizó las imprimaciones inversas OSM del terminal BC y del terminal C así como del OSM como la plantilla. Estos fragmentos purificados se utilizaron entonces como plantilla en la segunda reacción PCR junto con los imprimadores inversos OSM de terminal N hacia adelante y OSM terminales C para amplificar la secuencia de genes de bucle BC OSM LIF correspondiente. Después de la purificación y transformación en e-coli, los plásmidos individuales fueron aislados y examinados por la digestión enzimática de restricción para la inserción adecuada del fragmento de ADN.
La electroforesis de gel reveló impactos positivos que luego fueron enviados para la verificación de la secuencia. Las proteínas kimericas tienen que ser producidas y la actividad medida en un sistema de faccionalidad perfecto. Con el fin de determinar la importancia de las regiones reemplazadas para esa facción en particular.
Esta técnica ha sido muy útil y aplicada con frecuencia, interferido de los receptores de señal con el fin de identificar los dominios de función clave y los sitios de reconocimiento de receptores. El número que utilizo para la electroforesis de ADN debe manejarse mediante el uso de guantes desechables, un abrigo de laboratorio y gafas protectoras.
