La resonancia magnética funcional en estado de reposo, o fMRI en estado de reposo, se ha convertido en un método cada vez más popular para estudiar la función cerebral en un estado de reposo sin tareas. Los avances tecnológicos han permitido que la resonancia magnética funcional en estado de reposo se adapte para su uso en modelos de roedores, y se puede utilizar para descubrir mecanismos subyacentes a los estados de enfermedad. El protocolo descrito aquí combina dosis bajas de isoflurano con dosis bajas de dexmedetomidina, lo que permite la adquisición de datos de alta calidad y la preservación de la función de la red cerebral.
Este método también permite la respiración espontánea y la fisiología casi normal durante un período de hasta cinco horas. En este video, cubrimos el monitoreo de la fisiología de la rata durante cuatro fases distintas de anestesia, inducción y preparación animal, configuración animal, adquisición de escaneo anatómico y adquisición de escaneo en estado de reposo, seguido de una evaluación de calidad de los datos. Utilizando un sistema para administrar anestésico inhalado, así como para eliminar los gases residuales de todas las áreas necesarias, inducir anestesia con 2,5% de isoflurano en un 30% de aire enriquecido con oxígeno.
Una vez que el animal esté anestesiado, retírelo de la cámara, pese al animal y colóquelo en el cono de la nariz en la almohadilla térmica en el espacio de preparación, quedando al 2,5% de isoflurano. Aplique ungüento lubricante oftálmico en cada ojo para evitar el secado. Confirme la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta de pellizco del dedo del pie, use clippers para afeitar un área cuadrada de dos pulgadas por dos pulgadas en la región lumbar inferior de la espalda del animal directamente por encima de la cola.
Administrar 0,015 miligramos por kilogramo de la solución de dexmedetomidina con una inyección intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho del abdomen utilizando una aguja calibre 25. Cambie el flujo de isoflurano desde el espacio de preparación a la cuna del animal. Mueva al animal a la cuna del animal.
Coloque los dientes frontales de la rata de forma segura sobre y de la barra de mordida. Empuje el cono de la nariz sobre la nariz para asegurar un ajuste apretado. Si el cono de la nariz no cubre la mandíbula inferior, Parafilm se puede usar para mantener suavemente la mandíbula cerrada mientras se sella alrededor del cono de la nariz.
Coloque la almohadilla respiratoria debajo del abdomen del animal debajo de la caja torácica y reposicione hasta que la forma de onda de la respiración muestre un canal profundo centrado en cada respiración. Pase a la siguiente fase de la anestesia cuando la respiración sea inferior a 40 respiraciones por minuto. Inserte esas barras para los oídos en el canal auditivo para estabilizar la cabeza de la rata en la cuna del animal.
Una vez colocado, tire hacia adelante de la barra de mordida y confirme que la cabeza no se mueva. Reajuste el cono de la nariz y Parafilm según sea necesario. Inserte la sonda de temperatura en una cubierta de sonda desechable prelubricado.
Inserte suavemente la sonda de temperatura aproximadamente 1/2 pulgada en el recto y péguela con cinta adhesiva a la base de la cola con cinta médica. Coloque el clip del oxímetro de pulso en el área metatarsiano del pie trasero, asegurándose de que la fuente de luz esté en la parte inferior del pie. La rotación del clip puede afectar la señal, por lo tanto, crear un soporte para mantener la pata y el clip en posición vertical conducirá a una mayor estabilidad.
Calcule la velocidad de infusión para 0.015 miligramos por kilogramo por hora de dexmedetomidina. Establezca la bomba del medicamento a la velocidad de infusión calculada y llene la línea de infusión. Con una toallita con alcohol, limpie el área afeitada para eliminar cualquier vello perdido.
Pellizque la piel aproximadamente dos dedos de ancho por encima de la base de la cola. Inserte 1/3 de la aguja de la línea de infusión en la piel de la tienda. Asegure la aguja a la piel con un trozo de cinta médica ancha de tres pulgadas.
Coloque un segundo trozo de cinta médica ancha sobre el primero a través de la rata y unido a ambos lados de la cuna del animal. Es de vital importancia que la aguja ferromagnética esté bien asegurada para evitar el movimiento durante la exploración. Comience la infusión de dexmedetomidina subcutánea.
Coloque un trozo de gasa en el puente de la nariz de la rata para crear una superficie nivelada para la bobina. Use cinta de papel, que no interfiera con la señal de resonancia magnética, para asegurar la bobina a la cabeza de la rata, centrándola sobre el cerebro. Coloque toallas de papel sobre el animal, asegurándolas a la cuna del animal con cinta de laboratorio.
Si usa un sistema de calentamiento de aire, envuelva una lámina de plástico alrededor de toda la cuna para contener el aire caliente. Mueva al animal hacia el orificio y ajuste el imán. Reducir el isoflurano al 1,5%, lo que resulta en un aumento constante de la respiración a aproximadamente 45 a 50 respiraciones por minuto.
Permanecer en este nivel durante la duración de la exploración anatómica. Utilice el escaneo localizador FLASH para asegurarse de que el cerebro esté alineado con el isocentro magnético. Reposicione al animal y repita si es necesario.
Ejecute el escaneo localizador RARE de mayor resolución y use esta salida de escaneo para alinear 15 cortes sagitales centrados en todo el cerebro. Usando la rebanada sagital media, alinee la rebanada axial central con la decusación de la comisura anterior, que aparece como una mancha oscura. Anote el desplazamiento de división que se utilizará más adelante en los análisis de estado de reposo.
Adquiera 23 cortes utilizando los protocolos axiales FLASH y RARE para ayudar en el registro en un espacio común durante el análisis posterior al escaneo. Shim a través de todo el cerebro usando la secuencia PRESS. Después de completar las exploraciones anatómicas, reduzca el isoflurano a 0.5 a 0.75% ajustando para que la respiración del animal sea de 60 a 65 respiraciones por minuto.
Permanezca en este nivel durante al menos 10 minutos antes de comenzar el escaneo en estado de reposo para garantizar la estabilidad. Cuando la fisiología es estable, adquiera una exploración EPI de 15 cortes utilizando el mismo desplazamiento de corte que la serie axial anatómica. Una vez completado cada escaneo de estado de reposo, verifique la calidad utilizando un análisis de componentes independiente para descomponer los datos en componentes espaciales y temporales.
Obtenga al menos tres exploraciones de estado de reposo de alta calidad. Cuando se complete la exploración, aumente el isoflurano al 2% y detenga la infusión subcutánea de dexmedetomidina. Retire la cuna del animal del orificio del imán y devuelva al animal al espacio de preparación.
Inyecte 0.015 miligramos por kilogramo de la solución diluida de atipamezole en el músculo de la pata trasera de la rata con una aguja de calibre 25. Coloque a la rata de nuevo en la jaula de la casa encima de una almohadilla térmica y controle hasta que el animal sea ambulatorio. Mediante un análisis de componentes independiente, evalúe la estabilidad después de cada exploración en estado de reposo.
Aquí se muestra un ejemplo de muy alta estabilidad. Nótese que, espacialmente, los componentes tienen una alta regionalidad. Dentro del curso de tiempo que se muestra en el panel central, la señal es estable y no predecible, lo que es indicativo de la verdadera actividad cerebral.
El espectro de potencia en la parte inferior muestra predominantemente frecuencias bajas. Aquí se muestra un componente de ruido del mismo escaneo. Tenga en cuenta la no regionalidad, el curso de tiempo de alta frecuencia y el pico único de alta frecuencia en el espectro de potencia.
Los componentes de ruido deben eliminarse durante el análisis posterior al escaneo. Finalmente, este componente proviene de una exploración donde la anestesia no fue estable. El curso de tiempo que se muestra es variable e irregular.
Cuando esto sucede, se necesitan mejoras en el protocolo anestésico, comúnmente en el techo del cono de la nariz y la eliminación de gases residuales. La estabilidad del animal, tanto física como fisiológicamente, es clave para obtener datos de estado de reposo de alta calidad. Es imperativo que el animal cumpla con los umbrales fisiológicos establecidos antes de pasar a la siguiente fase de anestesia.
Siguiendo esta técnica de supervivencia, la resonancia magnética funcional en estado de reposo se puede utilizar en estudios longitudinales, junto con manipulaciones experimentales, y para explorar modelos de enfermedad. La combinación de dosis bajas de isoflurano con dexmedetomidina utilizada en este protocolo permite una amplia variedad de estudios preclínicos para investigadores interesados en obtener imágenes del cerebro del roedor en su estado de reposo.
