La risonanza magnetica funzionale allo stato di riposo, o fMRI a riposo, è diventata un metodo sempre più popolare per studiare la funzione cerebrale in uno stato di riposo non di attività. I progressi tecnologici hanno permesso di adattare la fMRI allo stato di riposo per l'uso in modelli di roditori e può essere utilizzata per scoprire i meccanismi alla base degli stati patologici. Il protocollo qui descritto combina isoflurano a basso dosaggio con dexmedetomidina a basso dosaggio, consentendo l'acquisizione di dati di alta qualità e la conservazione della funzione della rete cerebrale.
Questo metodo consente anche la respirazione spontanea e la fisiologia quasi normale per un massimo di cinque ore. In questo video, copriamo il monitoraggio della fisiologia del ratto durante quattro fasi distinte di anestesia, induzione e preparazione animale, configurazione animale, acquisizione di scansioni anatomiche e acquisizione di scansioni a riposo seguite da valutazione della qualità dei dati. Utilizzando un sistema per fornire anestetico inalato e eliminare i gas di scarico da tutte le aree necessarie, indurre l'anestesia con il 2,5% di isoflurano nel 30% di aria arricchita di ossigeno.
Una volta che l'animale è anestetizzato, rimuoverlo dalla camera, pesare l'animale e posizionarlo nel cono del naso sulla piastra riscaldante nello spazio di preparazione, rimanendo al 2,5% di isoflurano. Applicare un unguento lubrificante oftalmico su ciascun occhio per evitare l'essiccazione. Conferma la profondità dell'anestesia con una mancanza di risposta al pizzico della punta, Usa i clipper per radere un'area quadrata di due pollici per due pollici sulla regione lombare inferiore della schiena dell'animale direttamente sopra la coda.
Somministrare 0,015 milligrammi per chilogrammo di soluzione di dexmedetomidina con un'iniezione intraperitoneale nel quadrante inferiore destro dell'addome utilizzando un ago calibro 25. Commutare il flusso di isoflurano dallo spazio di preparazione alla culla dell'animale. Sposta l'animale nella culla dell'animale.
Posizionare saldamente i denti anteriori del topo sopra e nella barra del morso. Spingere il cono del naso sopra il naso per garantire una vestibilità aderente. Se il cono del naso non copre la mascella inferiore, Parafilm può essere utilizzato per tenere delicatamente la mascella chiusa mentre sigilla anche intorno al cono del naso.
Posiziona il pad respiratorio sotto l'addome dell'animale sotto la gabbia toracica e riposizionalo fino a quando la forma d'onda della respirazione mostra una depressione profonda centrata su ogni respiro. Passare alla fase successiva dell'anestesia quando la respirazione è inferiore a 40 respiri al minuto. Inserisci le barre auricolari nel condotto uditivo per stabilizzare la testa del ratto nella culla dell'animale.
Una volta posizionato, tirare in avanti sulla barra del morso e confermare che la testa non si muova. Riregolare il cono del naso e parafilm secondo necessità. Inserire la sonda di temperatura in un coperchio della sonda monouso prelubrificato.
Inserire delicatamente la sonda di temperatura di circa 1/2 pollice nel retto e fissarla alla base della coda con nastro adesivo medico. Posizionare la clip del pulsossimetro sulla zona metatarsale del piede posteriore, assicurandosi che la fonte di luce si trova sul fondo del piede. La rotazione della clip può influenzare il segnale, quindi, la creazione di un supporto per mantenere la zampa e la clip in posizione verticale porterà a una maggiore stabilità.
Calcolare la velocità di infusione per 0,015 milligrammi per chilogrammo all'ora di dexmedetomidina. Impostare la pompa del farmaco sulla velocità di infusione calcolata e riempire la linea di infusione. Usando una salvietta icool, pulire l'area rasata per rimuovere eventuali peli randagi.
Pizzicare la pelle di circa due dita sopra la base della coda. Inserire 1/3 dell'ago della linea di infusione nella pelle tendata. Fissare l'ago alla pelle con un pezzo da tre pollici di nastro medico largo.
Posiziona un secondo pezzo di nastro medico largo sopra il primo attraverso il ratto e attaccato a entrambi i lati della culla dell'animale. È di fondamentale importanza che l'ago ferromagnetico sia ben fissato per impedire il movimento durante la scansione. Iniziare l'infusione di dexmedetomidina sottocutanea.
Posiziona un pezzo di garza sul ponte del naso del ratto per creare una superficie piana per la bobina. Utilizzare nastro di carta, che non interferisce con il segnale MRI, per fissare la bobina alla testa del ratto, centrandola sul cervello. Posiziona gli asciugamani di carta sopra l'animale, fissandoli alla culla dell'animale con del nastro da laboratorio.
Se si utilizza un sistema di riscaldamento ad aria, avvolgere un foglio di plastica attorno all'intera culla per contenere l'aria calda. Sposta l'animale nel foro e sintonizza il magnete. Ridurre l'isoflurano all'1,5%, con conseguente aumento costante della respirazione a circa 45-50 respiri al minuto.
Rimanere a questo livello per tutta la durata della scansione anatomica. Utilizzare la scansione del localizzatore FLASH per assicurarsi che il cervello sia allineato con l'isocentro del magnete. Riposizionare l'animale e ripetere se necessario.
Esegui la scansione del localizzatore RARE ad alta risoluzione e utilizza questo output di scansione per allineare 15 fette sagittali centrate sul cervello. Usando la fetta sagittale centrale, allineare la fetta assiale centrale alla decussazione della commessura anteriore, che appare come una macchia scura. Prendete nota dell'offset della sezione da utilizzare in un secondo momento nelle scansioni dello stato di riposo.
Acquisisci 23 fette utilizzando i protocolli assiali FLASH e RARE per aiutare nella registrazione in uno spazio comune durante l'analisi post-scansione. Shim attraverso tutto il cervello usando la sequenza PRESS. Dopo aver completato le scansioni anatomiche, ridurre l'isoflurano allo 0,5-0,75% regolando in modo che la respirazione dell'animale sia da 60 a 65 respiri al minuto.
Rimanere a questo livello per almeno 10 minuti prima di iniziare la scansione dello stato di riposo per garantire la stabilità. Quando la fisiologia è stabile, acquisire una scansione EPI a 15 fette utilizzando lo stesso offset a fette della serie assiale anatomica. Al termine di ogni scansione dello stato di riposo, verificare la qualità utilizzando un'analisi dei componenti indipendente per scomporre i dati in componenti spaziali e temporali.
Ottenere almeno tre scansioni dello stato di riposo di alta qualità. Al termine della scansione, aumentare l'isoflurano al 2% e interrompere l'infusione sottocutanea di dexmedetomidina. Rimuovere la culla dell'animale dal foro del magnete e riportare l'animale nello spazio di preparazione.
Iniettare 0,015 milligrammi per chilogrammo della soluzione diluita di atipamezolo nel muscolo della zampa posteriore del ratto usando un ago calibro 25. Rimettete il topo nella gabbia di casa sopra una piastra riscaldante e monitorate fino a quando l'animale non è deambulante. Utilizzando un'analisi indipendente dei componenti, valutare la stabilità dopo ogni scansione dello stato di riposo.
Mostrato qui è un esempio di stabilità molto elevata. Si noti che, spazialmente, i componenti hanno un'elevata regionalità. All'interno del corso temporale mostrato nel pannello centrale, il segnale è stabile e non prevedibile, il che è indicativo della vera attività cerebrale.
Lo spettro di potenza nella parte inferiore mostra prevalentemente basse frequenze. Di seguito è mostrato un componente di disturbo della stessa scansione. Si noti la non regionalità, il corso temporale ad alta frequenza e il singolo picco ad alta frequenza nello spettro di potenza.
I componenti del rumore devono essere rimossi dal rumore durante l'analisi post-scansione. Infine, questo componente proviene da una scansione in cui l'anestesia non era stabile. Il percorso temporale visualizzato è variabile e irregolare.
Quando ciò accade, sono necessari miglioramenti al protocollo anestetico, comunemente al soffitto del cono del naso e allo scavenging dei gas di scarico. La stabilità dell'animale, sia fisicamente che fisiologicamente, è la chiave per ottenere dati di alta qualità sullo stato di riposo. È imperativo che l'animale soddisfi le soglie fisiologiche stabilite prima di passare alla fase successiva dell'anestesia.
Seguendo questa tecnica di sopravvivenza, la fMRI allo stato di riposo può essere utilizzata in studi longitudinali, in combinazione con manipolazioni sperimentali, e per esplorare modelli di malattia. La combinazione di isoflurano a basso dosaggio con dexmedetomidina utilizzata in questo protocollo consente un'ampia varietà di studi preclinici per i ricercatori interessati a visualizzare il cervello del roditore nel suo stato di riposo.
