A ressonância magnética funcional de estado de repouso, ou fMRI de estado de repouso, tornou-se um método cada vez mais popular para estudar a função cerebral em um estado de repouso sem tarefa. Os avanços tecnológicos permitiram que o FMRI do estado de repouso fosse adaptado para uso em modelos de roedores, e pode ser usado para descobrir mecanismos subjacentes aos estados da doença. O protocolo descrito aqui combina isoflurane de baixa dose com dexmedetomidina de baixa dose, permitindo a aquisição de dados de alta qualidade e preservação da função da rede cerebral.
Este método também permite a respiração espontânea e fisiologia quase normal por até cinco horas. Neste vídeo, abrangemos o monitoramento da fisiologia do rato durante quatro fases distintas de anestesia, indução e preparação animal, configuração animal, aquisição de escaneamento anatômico e aquisição de escaneamento de estado de repouso seguido de avaliação de qualidade dos dados. Usando um sistema para fornecer anestésico inalado, bem como respire gases residuais de todas as áreas necessárias, induzir anestesia com 2,5% de isoflurane em ar enriquecido com oxigênio de 30%.
Uma vez que o animal é anestesiado, remova-o da câmara, pese o animal e coloque-o no cone do nariz na almofada de aquecimento no espaço de preparação, permanecendo em 2,5% isoflurane. Aplique pomada lubrificante oftálmica em cada olho para evitar a secagem. Confirme a profundidade da anestesia por falta de resposta ao dedo do pé, use cortadores para raspar uma área quadrada de duas polegadas por duas polegadas na região lombar inferior das costas do animal diretamente acima da cauda.
Administre 0,015 miligramas por quilograma da solução de dexmedetomidina com uma injeção intraperitoneal no quadrante inferior direito do abdômen usando uma agulha de calibre 25. Troque o fluxo isoflurane do espaço de preparação para o berço animal. Mova o animal para o berço animal.
Coloque os dentes da frente do rato firmemente sobre e dentro da barra de mordida. Empurre o cone do nariz sobre o nariz para garantir um ajuste apertado. Se o cone do nariz não cobrir a mandíbula inferior, o Parafilm pode ser usado para segurar suavemente a mandíbula fechada enquanto também sela ao redor do cone do nariz.
Posicione a almofada de respiração sob o abdômen do animal abaixo da caixa torácica e reposicione-a até que a forma de onda de respiração mostre um cocho profundo centrado em cada respiração. Mova-se para a próxima fase da anestesia quando a respiração for inferior a 40 respirações por minuto. Insira as barras de ouvido no canal auditivo para estabilizar a cabeça do rato no berço animal.
Uma vez posicionado, puxe para a frente na barra de mordida e confirme que a cabeça não se move. Reajuste o cone do nariz e o Parafilm conforme necessário. Insira a sonda de temperatura em uma tampa de sonda descartável pré-lubrificada.
Insira suavemente a sonda de temperatura aproximadamente 1/2 polegada no reto e tape-a na base da cauda com fita médica. Coloque o clipe do oxímetro de pulso sobre a área metatarsal do pé traseiro, garantindo que a fonte de luz esteja na parte inferior do pé. A rotação do clipe pode afetar o sinal, assim, criar um suporte para manter a pata e o clipe ereto levará a uma maior estabilidade.
Calcule a taxa de infusão de 0,015 miligramas por quilograma por hora de dexmedetomidina. Coloque a bomba de droga na taxa de infusão calculada e encha a linha de infusão. Usando uma limpeza de álcool, limpe a área raspada para remover qualquer cabelo perdido.
Aperte a pele aproximadamente duas larguras de dedos acima da base da cauda. Insira 1/3 da agulha da linha de infusão na pele de tenda. Segure a agulha na pele com um pedaço de fita médica de 3 polegadas.
Coloque um segundo pedaço de fita médica larga sobre o primeiro através do rato e preso a ambos os lados do berço animal. É extremamente importante que a agulha ferromagnética esteja bem protegida para evitar o movimento durante a varredura. Comece a infusão de dexmedetomidina subcutânea.
Coloque um pedaço de gaze na ponte do nariz do rato para criar uma superfície nivelada para a bobina. Use fita de papel, que não interfere com o sinal de ressonância magnética, para fixar a bobina na cabeça do rato, centralizando-a sobre o cérebro. Coloque toalhas de papel sobre o animal, prendendo-as ao berço animal com fita de laboratório.
Se usar um sistema de aquecimento de ar, enrole uma folha de plástico em torno de todo o berço para conter o ar quente. Mova o animal para dentro do furo e sintonize o ímã. Reduza o isoflurane para 1,5%, resultando em um aumento constante da respiração para aproximadamente 45 a 50 respirações por minuto.
Permaneça neste nível durante a duração da varredura anatômica. Use a varredura do localizador FLASH para garantir que o cérebro esteja alinhado com o isocentro do ímã. Reposicione o animal e repita se necessário.
Execute a varredura de localizador RARE de maior resolução e use esta saída de varredura para alinhar 15 fatias sagiais centradas em todo o cérebro. Usando a fatia sagital média, alinhe a fatia axial central à descussação da comissure anterior, que aparece como uma mancha escura. Observe o deslocamento da fatia para usar mais tarde nas varreduras de estado de repouso.
Adquira 23 fatias usando os protocolos axiais FLASH e RARE para auxiliar no registro em um espaço comum durante a análise pós-digitalização. Shim por todo o cérebro usando a sequência press. Após a conclusão dos exames anatômicos, reduza o isoflurane para 0,5 a 0,75% de ajuste para que a respiração do animal seja de 60 a 65 respirações por minuto.
Permaneça neste nível por pelo menos 10 minutos antes de iniciar a varredura de estado de repouso para garantir a estabilidade. Quando a fisiologia estiver estável, adquira uma varredura EPI de 15 fatias usando o mesmo deslocamento de fatia da série axial anatômica. Após cada varredura de estado de repouso ser concluída, verifique a qualidade usando uma análise de componentes independente para decompor os dados em componentes espaciais e temporais.
Obtenha pelo menos três exames de estado de repouso de alta qualidade. Quando a varredura estiver completa, aumente o isoflurane para 2% e pare a infusão dexmedetomidina subcutânea. Retire o berço animal do furo do ímã e devolva o animal ao espaço de preparação.
Injete 0,015 miligramas por quilograma da solução de atipamezole diluída no músculo da perna traseira do rato usando uma agulha de calibre 25. Coloque o rato de volta na gaiola em cima de uma almofada de aquecimento, e monitore até que o animal esteja ambulatorial. Utilizando uma análise de componentes independente, avalie a estabilidade após cada varredura de estado de repouso.
Mostrado aqui é um exemplo de estabilidade muito alta. Note-se que, espacialmente, os componentes têm alta regionalidade. Dentro do curso de tempo mostrado no painel do meio, o sinal é estável e não previsível, o que é indicativo da verdadeira atividade cerebral.
O espectro de energia na parte inferior mostra frequências predominantemente baixas. Mostrado aqui é um componente de ruído da mesma varredura. Observe a não-regionalidade, curso de tempo de alta frequência e pico único de alta frequência no espectro de energia.
Os componentes de ruído devem ser des-nolizados durante a análise pós-varredura. Finalmente, este componente é de uma varredura onde a anestesia não estava estável. O curso de tempo exibido é variável e irregular.
Quando isso acontece, são necessárias melhorias no protocolo anestésico, comumente no teto do cone do nariz e na limpeza de gases residuais. A estabilidade do animal, tanto física quanto fisiologicamente, é fundamental para obter dados de estado de repouso de alta qualidade. É imperativo que o animal atenda aos limiares fisiológicos estabelecidos antes de passar para a próxima fase da anestesia.
Seguindo essa técnica de sobrevivência, o estado de repouso pode ser usado em estudos longitudinais, em conjunto com manipulações experimentais, e para explorar modelos de doenças. A combinação de isoflurano de baixa dose com dexmedetomidina utilizada neste protocolo permite uma grande variedade de estudos pré-clínicos para pesquisadores interessados em imagem do cérebro roedor em seu estado de repouso.
