En este video, describimos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas para capturar imágenes del hongo modelo aspergillus nidulans, utilizando técnicas de microscopía de luz transmitida. Utilizamos estas imágenes para analizar y cuantificar la cinética de crecimiento de aspergillus nidulans en medios líquidos y sólidos. Una representación visual de este protocolo permite a los usuarios familiarizarse con los pasos significativos de la captura de imágenes y el procesamiento de imágenes de microscopía.
Un método común utilizado para medir el crecimiento de hongos filamentosos son dos esporas de hongos inoculados en una placa de Petri que contiene agar nutriente y para medir el diámetro de la colonia en desarrollo unos días después. Sin embargo, este enfoque no es lo suficientemente sensible como para cuantificar las diferencias finas de crecimiento. Por lo tanto, se desarrollaron mediciones de una sola célula utilizando microscopía de lapso de tiempo.
Estas mediciones son capaces no solo de proporcionar resultados precisos y cuantitativos, sino también de reflejar la dinámica de crecimiento de diferentes células dentro de una población. Además, este enfoque tiene como objetivo comprender mejor los mecanismos moleculares involucrados en las respuestas de crecimiento de hongos a las señales endógenas y ambientales. Comience vertiendo 15 mililitros de agar nutriente líquido en placas de Petri.
Coloque la tapa en la parte superior y deje que se enfríe. Use radiación UV para esterilizar placas. Antes de eliminar la cepa fúngica de interés de una cepa, caliente el bucle ondulante en el quemador Bunsen hasta que esté al rojo vivo, enfríe el bucle apuñalándolo en el agar.
Vórtice el tubo y raye el bucle a través de la superficie del medio mínimo de agar suplementado con los requisitos nutricionales apropiados. Incubar placas durante dos o tres días a 37 grados centígrados. Usando un palillo de dientes estéril, transfiera un pequeño número de conidios tocando suavemente una sola colonia a placas de medios completos.
Incubar placas durante tres o cuatro días a 37 grados centígrados. Los conidios de aspergillus nidulans, se cosechan en un tubo de vórtice estéril de 1,5 mililitros, con 1,0 mililitros de agua destilada en autoclave que contiene 0,05% de volumen por volumen, Tween 80, para reducir el número de grupos de conidios. Una versión modificada del método del agar invertido se utiliza para obtener imágenes de hongos filamentosos en la superficie media del agar.
Inicialmente detectar 10 alícuotas de microlitros de suspensión conidial vigorosamente vórtice, aproximadamente dos veces 104 células por mililitro en placas de Petri de 15 mililitros de medio mínimo con un peso por volumen de agar. Incubar el cultivo experimental de acuerdo a la etapa de desarrollo a investigar. Aquí incubamos durante tres días a 30 grados centígrados.
Después, corte un bloque de agar que contenga la colonia, usando un bisturí estéril. Aquí cortamos una cuña de agar en el margen de la colonia, invertimos y colocamos la rodaja de agar en un ocho, bien deslizable. Transfiera 10 alícuotas de microlitros de suspensión conidial vigorosamente vórtice de aproximadamente dos veces 10 en la potencia de cuatro en los pozos de un portaobjetos de pozo que contenga 200 microlitros de medio mínimo con los suplementos apropiados.
Incubar durante el tiempo y la temperatura a examinar cada vez. La elección del microscopio depende del equipo disponible. En cualquier caso, la configuración del microscopio debe incluir una etapa invertida, una cámara ambiental o al menos una habitación con un control preciso de la temperatura del aire.
Inicialmente precaliente el termostato y la cámara del microscopio para estabilizar la temperatura deseada. Aquí fijamos la temperatura en 30 grados centígrados. Encienda el microscopio, la potencia del escáner, la alimentación del láser y la computadora, y cargue el software de imágenes.
Coloque el portaobjetos de pozo previamente preparado en la etapa de microscopio y enfoque. Encuentre campos de visión que contengan celdas aisladas, no superpuestas, o al menos no superpobladas, para facilitar las mediciones de crecimiento durante el análisis de imágenes. Seleccione la técnica de microscopía de luz transmitida que se utilizará y active el detector de luz transmitida, así como los detectores de fluorescencia cuando sea necesario.
Configure el microscopio para adquirir imágenes a los intervalos de tiempo deseados e iniciar la adquisición de series temporales. La carga, visualización y procesamiento de imágenes se realiza con el software de código abierto imageJ Fiji. Comience importando las imágenes a Fiji usando plugins por un formato.
Seleccione el modo de color predeterminado y la escala automática. Para visualizar una marca de tiempo y una barra de escala como superposición vaya a analizar, herramientas, barra de escala. Establezca los parámetros deseados con respecto al ancho, la altura, el color y la ubicación de la barra de escala.
Vaya a imagen, propiedades, para mostrar las propiedades de imagen en el software imageJ Fiji. Observe la información del intervalo de fotogramas. Aquí usamos un intervalo de tiempo de aproximadamente 15 minutos y presionamos OK.
Luego vaya a la imagen, las pilas, la etiqueta y establezca la información correcta en intervalo. Establezca la ubicación de la etiqueta modificando X e Y.Establezca la unidad de medida en el texto del campo y presione vista previa. Utilice la coincidencia de histogramas para la corrección de iluminación entre diferentes fotogramas seleccionando imagen, ajuste, corrección de blanqueamiento, coincidencia de histogramas.
Aparece una nueva ventana con iluminación corregida. Use el complemento MtrackJ en los complementos, MtrackJ, para rastrear la punta hifal creciente Para agregar la pista, seleccione el botón agregar en la barra de herramientas y coloque el primer punto en la punta hifal con el clic izquierdo del mouse. La serie temporal se moverá automáticamente al siguiente fotograma.
Para completar el proceso de seguimiento, haga doble clic con el mouse en el punto final o presione la tecla de escape. Desplazarse por la tabla de salida, la columna más importante para calcular el crecimiento de la punta hifal, es la velocidad en cualquier fotograma dado. Realice un seguimiento seguro de las mediciones, agregue el archivo, guarde como, al formato de archivo de su elección, por ejemplo, CSV, importe el archivo guardado en su programa de hoja de cálculo y calcule la visualización y otras pruebas.
Presione el botón de película para generar una película, tipo de color RGB, que contenga los fotogramas con las pistas dibujadas en ellos, que se puede visualizar en cualquier reproductor multimedia estándar. Siguiendo este protocolo, capturamos y analizamos diversas imágenes correspondientes a diferentes etapas de crecimiento y desarrollo del hongo filamentoso aspergillus nidulans. La figura muestra la comparación de las mediciones de la tasa de crecimiento del tipo salvaje y azhAD Delta ngnA Delta.
La azhAD Delta ngnA Delta es una cepa doblemente eliminada en dos genes implicados en la desintoxicación y asimilación del producto combatiente tóxico L añadido en dos ácidos carboxílicos. Muestra mediciones estadísticamente significativas de menor tasa de crecimiento en comparación con la cepa de tipo salvaje en cultivos líquidos sumergidos. Esta diferencia en el crecimiento no es detectable midiendo el área de colonia de estas dos cepas en medio mínimo sólido.
Las imágenes en vivo a largo plazo de una sola célula son de gran valor en el esfuerzo por obtener información espacial y temporal de la dinámica de las proteínas celulares. Este protocolo es adecuado también para llevar a cabo imágenes de células vivas a largo plazo. Aquí vemos la germinación de los conidios co-expresando la proteína eisosomal del núcleo etiquetado con GFP PilA y la histona MRFP H1. Aquí en presentamos un protocolo para analizar la cinética de crecimiento fúngico de una manera reproducible y confiable sin la necesidad de ninguna experiencia previa de análisis de imágenes por parte del usuario.
Este protocolo permite una cuantificación objetiva y precisa del crecimiento de hongos.
