本ビデオでは、透過光顕微鏡技術を用いて、モデル真菌アスペルギルスニドゥランの画像をキャプチャするラベルフリーライブイメージングプロトコルについて説明します。この画像を使用して、液体および固体媒体の両方におけるアスペルギルスニデュランの成長速度を分析し、定量化します。このプロトコルを視覚的に表現することで、画像のキャプチャと顕微鏡による画像処理の重要な手順に精通することができます。
糸状菌の成長を測定するために使用される一般的な方法は、栄養寒天を含むペトリ皿の2つの接種真菌胞子であり、数日後に現生コロニーの直径を測定する。しかし、この方法は、微細な成長の違いを定量化するのに十分な感度ではありません。そこで、タイムラプス顕微鏡を用いた単一細胞測定が開発された。
この測定は、正確で定量的な結果を提供するだけでなく、集団内の異なる細胞の成長ダイナミクスを反映することができます。さらに、このアプローチは、内因性および環境シグナルに対する真菌増殖応答に関与する分子メカニズムをよりよく理解することを目的としている。ペトリ皿に液体栄養寒天の15ミリリットルを注ぐことから始めます.
蓋を上に置き、冷まします。プレートを殺菌するためにUV放射を使用してください。ストックから目的の真菌株を抜く前に、ブンゼンバーナーの結節ループを赤く熱くなるまで加熱し、寒天に刺してループを冷やします。
チューブをボルテックスし、適切な栄養要件を補う寒天最小培地の表面を横切ってループをストリーク.37°Cで2〜3日間プレートをインキュベートします。滅菌爪楊枝を使用して、単一のコロニーを穏やかに触って、少数のコニディアを完全な培地のプレートに移す。
37°Cで3〜4日間プレートをインキュベートします。アスペルギルスニドゥランのコニディアは、無菌1.5ミリリットルの渦管で収穫され、1.0ミリリットルのオートクレーブ蒸留水が体積当たり0.05%の体積を含む、Tween 80、コニディア塊の数を減らすためである。逆寒天法の改変バージョンは、寒天培地表面上の糸状菌を撮影するために使用される。
最初は激しく渦のコニアル懸濁液の10マイクロリットルアリコートをスポットし、15ミリリットルのペトリ皿に1ミリリットル当たり約2倍の104細胞を、体積寒天あたり1重量で最小培地で発見する。実験培養を検討する発達段階に従ってインキュベートする。ここでは摂氏30度で3日間インキュベートします。
その後、コロニーを含む寒天のブロックをスライスし、滅菌メスを使用する。ここでは、コロニーマージンで寒天のくさびを切り取り、反転し、寒天スライスを8つのよくスライドさせます。適切なサプリメントを有する最低培地の200マイクロリットルを含むウェルスライドのウェルスライドの4のパワーで約2回の活発な渦のコニアル懸濁液の10マイクロリットルのアリコートを移す。
毎回検査される時間と温度をインキュベートする。顕微鏡の選択は利用できる装置によって異なる。いずれの場合も、設置された顕微鏡は、反転ステージ、環境室、または正確な温度制御を備えた少なくとも部屋を含む必要があります。
最初にサーモスタットと顕微鏡室を予熱して、所望の温度を安定させます。ここでは、摂氏30度の温度を設定します。顕微鏡、スキャナーの電源、レーザーパワー、コンピュータをオンにし、イメージングソフトウェアをロードします。
あらかじめ用意したよくスライドした顕微鏡の段階に置き、焦点を合わせます。画像解析中の成長測定を容易にするために、細胞が重複しない、または少なくとも過密でない孤立した視野を見つけます。使用する透過光顕微鏡技術を選択し、必要に応じて透過光検出器と蛍光検出器を活性化します。
所望の時間間隔で画像を取得し、時系列取得を開始するように顕微鏡を設定します。画像の読み込み、視覚化、処理はオープンソースのイメージJフィジーソフトウェアで達成されます。フォーマットでプラグインを使用してフィジーに画像をインポートすることで始めます。
既定のカラー モードと自動スケールを選択します。オーバーレイとしてタイムスタンプとスケールバーを視覚化するために、分析、ツール、スケールバーに行きます。スケール バーの幅、高さ、色、および位置に関する必要なパラメータを設定します。
imageJ フィジー ソフトウェアでイメージ プロパティを表示するには、イメージ、プロパティに移動します。フレーム間隔情報を確認します。ここでは、約15分の時間間隔を使用し、大丈夫を押します。
次に、画像、スタック、ラベルに移動し、正しい情報を間隔に設定します。X と Y を変更してラベルの位置を設定します。ヒストグラムマッチングを使用して、画像を選択し、調整、漂白剤補正、ヒストグラムマッチングを選択することで、異なるフレーム間の照明補正に使用します。
修正されたイルミネーションを持つ新しいウィンドウが表示されます。プラグイン、MtrackJでMtrackJプラグインを使用して、成長する催眠チップを追跡するトラックを追加するには、ツールバーの追加ボタンを選択し、マウスの左クリックを使用して、催眠先端に最初のポイントを配置します。時系列は自動的に次のフレームに移動します。
追跡処理を完了するには、最後のポイントでマウスをダブルクリックするか、エスケープキーを押します。催眠チップの成長を計算するための最も重要な列である出力テーブルをスクロールすることは、任意のフレームでの速度です。安全なトラックの測定値、ファイルの追加、名前を付けて保存、CSV など、選択したファイル形式に保存、保存されたファイルをスプレッドシートプログラムにインポートし、可視化とさらなるテストを計算します。
ムービーボタンを押すと、トラックが取り込まれたフレームを含むムービー RGB カラータイプが生成され、標準のマルチメディアプレーヤーで視覚化できます。このプロトコルに従って、糸状菌アスペルギルスニデュランの異なる成長および発達段階に対応する様々な画像を取り込み、分析した。野生型とazhADデルタngnAデルタの成長率測定の比較を図に示します。
azhAD Delta ngnA Deltaは、2つのカルボン酸に添加された有毒戦闘機製品Lの解毒および同化に関与する2つの遺伝子における二重欠損株である。水没した液体培養物における野生型株と比較して、統計的に有意な低成長速度測定値を示す。この成長の違いは、固体最小培地中でこれら2株のコロニー面積を測定することによって検出できない。
単一細胞、長期ライブイメージングは、細胞タンパク質ダイナミクスの容量および時間情報を得る努力において有意な価値がある。このプロトコルは、長期の生細胞イメージングを行う場合にも適しています。ここでは、コアアイソソームタンパク質PilAとmRFPヒストネンH1とGFP標識を共同発現するコニディアの発芽を見る。ここでは、ユーザーからの画像解析経験を必要とせずに、再現性と信頼性の高い方法で真菌増殖性キネティクスを分析するためのプロトコルを提示する。
このプロトコルは、真菌の成長の客観的な正確な定量化を可能にする。
