We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

1. Crear el programa de instalación <ol><li> Elija un escáner de superficie plana con resolución óptica: 4800 dpi; Resolución del hardware: 4800 x 9600 dpi; color de la profundidad de bits: 48 bits, que puede operar en los niveles de temperatura y humedad pertinentes. </li><li> Placas de Petri tienen volumen significativo, a diferencia del papel generalmente utilizado en escáneres comerciales. Las colonias se encuentran en la parte superior de la capa de agar, unos 5 mm por encima de la superficie del escáner. Nota: Para la mayoría de los escáneres de las colonias estarán enfocados. </li><li> Algunas empresas del escáner no permiten la conexión de más de una instancia de escáner del mismo tipo para el mismo equipo. Asegúrese de que más de un escáner se puede conectar y se identifica de forma única. </li><li> Prepare los accesorios que se detallan a continuación: <ol><li> Preparar piezas de negro estéril sentían paño para cubrir las placas (figura 1, paso 2). </li><li> Para sostener las placas de Petri en el lugar, preparar a los propietarios de placas blancas (Materiales y Métodos) que se ajustan a los escáneres y que tienen 6 holES el tamaño de los platos (Figura 1 paso 3). </li></ol></li><li> Si es necesario para el crecimiento del microorganismo, poner los escáneres en un entorno de temperatura controlada. Conecte el escáner a la computadora. </li><li> Opcional: Conecte el relé al ordenador sin pasar por el interruptor de encendido / apagado del escáner para superar gradiente de temperatura. NOTA: La unidad de relé es de extremadamente sensibles a la temperatura microorganismos. Se apaga el escáner para que la electrónica no calientan la superficie desigual. El uso de sólo una parte de la superficie del escáner, pueden lograr resultados similares. </li></ol> 2. Instale el Gestor de Escaneado <ol><li> Copie todos los archivos de la aplicación &quot;Gestor de escaneado&quot; en un directorio designado por http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. </li><li> Configurar archivo ScanningManager.exe.config según los nombres escáneres como aparecen en Gestión-&gt;-&gt; Administrador de Dispositivos de Captura de Imagen de dispositivos ( <strong&gt; Figura 2). </li><li> Para solucionar problemas de la aplicación &quot;Gestor de escaneado &#39;, veo el archivo Léame. </li><li> Encontrará la documentación de la aplicación &#39;Escaneo Administrador&#39;, ver Documentation.html. </li></ol> 3. Lleve a cabo un experimento <ol><li> Preparar las placas de Petri (Figura 1): <ol><li> Diluir la cultura hasta aproximadamente 2000 CFU / ml. Placa 0,1 ml de cultivo de manera uniforme sobre la superficie de la placa. </li><li> Para obtener un buen contraste entre las colonias y el plato, y para absorber la humedad, cubra el plato con un pedazo de negro estéril sintió tela. Ponga la tapa en la placa. </li></ol></li><li> Coloque las placas en los titulares de los escáneres. </li><li> Inicie el Administrador de Análisis (figura 3): Seleccione el escáner que participan desde la lista de escáneres conectados. Elija el número de imágenes que se deben tomar (repeticiones), el intervalo de tiempo entre las imágenes siguientes (La distancia de tiempo), y el retardo de tiempo antes de comenzar tque experimentar (inicia después). </li></ol> 4. Análisis de las Imágenes NOTA: Se proporciona un resumen de los métodos computacionales para el análisis de las imágenes en MATLAB utilizando &quot;ScanLag&quot;, que está disponible gratuitamente para uso no comercial en http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. HTML. Otras funciones disponibles se indican en el manual de software, y se complementa un código de ejemplo. <ol><li> Ordena las imágenes de cada escáner en carpetas separadas. </li><li> Usando la ventana de comandos del Matlab, ejecute los siguientes procedimientos. Los parámetros necesarios para ejecutar estos procedimientos se definen en el manual del software. <ol><li> Ejecute PreparePictures para realizar el preprocesamiento: En pre-procesamiento, las imágenes desde un escáner están alineados. Cada placa de Petri se recorta de cada secuencia de imágenes. El momento en que se recogió cada imagen se recupera de la marca de tiempo. </li><li> TLAllPlates de ejecución para realizar la detección y seguimiento En each plato Petri por separado, las colonias se detectan y se le asigna un número de identificación. </li><li> Análisis de los datos extraídos: Los tamaños de todas las colonias detectadas se mide como una función del tiempo. Para extraer la distribución aparición de las colonias utilizar las siguientes funciones en la ventana de comandos del Matlab (más información está disponible en el manual del software): <ol><li> Ejecutar ScanLagApp para mostrar el análisis de un cierto plato de Petri junto con el gráfico de las colonias dimensionar en función del tiempo (Figura 4). <ol><li> Utilice el control deslizante para cambiar la hora actual de la placa. El momento también se indicará mediante una línea vertical correspondiente en el gráfico de áreas colonias. </li><li> Haga clic en una colonia para ver su curva asociada y, viceversa, haga clic en una curva para encontrar su colonia asociada. Después de la identificación de la colonia, el fenotipo puede ser recuperada recogiendo la colonia de la placa de Petri identificado. </li><li> Filtrar los defectos en el análisis automático por choocantar una colonia y haciendo clic en el botón de exclusión. Al hacer clic excluye el número de la colonia se vuelve amarillo. </li></ol></li><li> Después de pasar por los resultados del análisis de cada placa, resumir los resultados: <ol><li> Ejecutar AddHistograms para crear un histograma de tiempos de aparición. </li><li> Ejecutar plotDeathCurve para crear una curva de supervivencia representación de la distribución. </li><li> Ejecute GetAppearanceTimes para obtener el tiempo de aparición de todas las colonias en el experimento. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+bacterial+colony+growth+as+a+tool+to+study+individual+lag+time+distributions+of+immobilized+cells.">Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).</li><li>Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+modulate+the+potential+for+evolution+of+resistance.">Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).</li><li>Ernebjerg, M., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Growth+Strategies+of+Soil+Bacteria+as+Revealed+by+Large-Scale+Colony+Tracking.">Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).</li><li>Rotem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phenotypic+variability+by+a+threshold-based+mechanism+underlies+bacterial+persistence.">Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bactericidal+action+of+penicillin+on+staphylococcus+pyogenes.">The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes.</a> Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiol. 13, 25 (2013).</li><li>Moyed, H. S., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hipa+a+Newly+Recognized+Gene+of+Escherichia-Coli+K-12+That+Affects+Frequency+of+Persistence+after+Inhibition+of+Murein+Synthesis.">Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis.</a> Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).</li><li>Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence:+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability.">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21, 768-775 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Métodos microscópicos basados ​​en la observación directa se consideran a menudo como el &quot;estándar de oro&quot; para el estudio de la conducta de una sola célula. ScanLag, que permite la medición de la distribución de los tiempos de retardo en las poblaciones de bacterias, proporciona datos en buen acuerdo con la distribución obtenida a partir del análisis de una sola célula y alcanza estadísticas mucho más altas. Varios pasos críticos tienen que ser realizadas para que este método funcione bien: primero, no ponen en peligro la resolución del escáner, que debe ser 4800 x 9600 para obtener buenas imágenes. En segundo lugar, ser conscientes de que sin el módulo de administración de energía (paso 1.6), gradiente de temperatura se puede desarrollar en la superficie plana y afectar el crecimiento. Otro paso importante es la filtración de defectos tales como polvo que puede haber sido contabilizado erróneamente como colonias por el software. La resta incorporado fondo del software generalmente supera estos defectos, pero las colonias a veces &quot;falsas&quot; quefiltrar manualmente. Los principales pasos para solucionar problemas podrían abordar la variación entre placas en la configuración, debido a varias razones: (a) La tasa de crecimiento de los microorganismos se ve afectada por la temperatura. Las diferentes condiciones de temperatura y humedad pueden ocurrir debido a la ventilación desigual o ubicación de la antena en la incubadora. (B) La electrónica del escáner pueden calentarse y causar un gradiente de temperatura a través de la superficie del escáner. La Figura 10 muestra la influencia de tales gradiente de calor espacial sobre las bacterias Bacillus, junto con las mediciones de la temperatura en la superficie del escáner antes y después de la implementación del módulo de administración de energía (paso 1.6). Tenga en cuenta que puede no ser necesario para los nuevos escáneres de este módulo, y si se utiliza sólo una parte de la superficie del escáner, la administración de energía puede ser innecesario. (C) Las placas con diferente opacidad del nutriente agar pueden dar lugar a diferentes niveles de detección. Figura 11 muestra thtolerancia e para diferentes volúmenes de agar nutriente que resultan en diferentes opacidades. Experimentalmente la técnica ScanLag es fácil de realizar y requiere sólo a la placa microorganismos en los platos de Petri estándar, y para colocarlos en la superficie del escáner. El software que fue desarrollado controla todo el procedimiento. La adquisición de imágenes se realiza automáticamente, y el análisis de imágenes para el seguimiento de colonia también es automática. Además, el sistema se puede escalar en marcha para medir muchas condiciones diferentes al mismo tiempo. Finalmente, el método se basa en escáneres de oficinas comerciales y, por lo tanto, es de bajo costo. Esta técnica se puede ampliar para el estudio de los microorganismos que se diferencian a partir de E. coli K-12, sin embargo varias consideraciones tiene que ser hecho. En primer lugar, la influencia de las colonias que aparecen primeros en las posteriores tiene que ser evaluada, como se describe en detalle en una publicación previa 7. Para E. Coli K-12, lala densidad máxima de UFC por placa es 200. Otras cepas con diferentes tamaños de las colonias, y otra diafonía posible entre colonias, podría requerir una densidad diferente. En segundo lugar, el análisis de las placas está calibrado para software basado en umbrales específicos que podrían necesitar ser modificada, dependiendo del contraste entre el medio sólido y las colonias. El software se puede extender también para extraer otras características de las colonias, más allá de retardo y tasa de crecimiento. El código de software está abierto y se puede modificar para extraer la forma de colonias, el brillo, la suavidad y el color. Debido a que las mediciones se realizan en las colonias que se originan a partir de células individuales, los datos revelan nuevos fenotipos que no pueden ser medidas por las mediciones de nivel de población. La importancia de la distribución del tiempo de retardo se revela en la presencia de antibióticos. Muchos antibióticos son conocidos por ser eficaces sólo contra células en crecimiento; Por lo tanto, siempre y cuando las células se mantienen en la fase de latencia y no crecen, son proprotegidos de los efectos de esos antibióticos 21. Cuando el número de bacterias sobrevivientes se evalúan a intervalos de tiempo durante el tratamiento antibiótico 15,22,23, una subpoblación de bacterias, llamado persisters, a menudo se reveló. En ciertos casos, la inmunidad al tratamiento con antibióticos se origina a partir de retraso prolongado. Utilizando esta configuración, este retraso se revela y con frecuencia tiene una distribución no trivial 24 (Figura 6). Este método también permite la recuperación de mutantes raros. Por ejemplo, después de la siembra de una población mutagenizada, mutantes pueden identificarse basándose en el fenotipo y aislar directamente, sin selección. La configuración también podría monitorear las interacciones célula-célula midiendo el crecimiento de las colonias como una función de la densidad de las colonias cercanos y para cuantificar fenómenos tales como la detección de quórum o la propagación de bacterias que pululan. Información Multidimensional descubierto por futuros experimentos utilizando este método dará lugar a una mejor caracterización de la población microbianas y a los avances en la investigación médica y ambiental.

Las bacterias han evolucionado para responder a muchas de las condiciones estresantes. Una característica general de adaptación al estrés es un cambio en la dinámica de crecimiento de 1,2. La dinámica del crecimiento se caracterizan principalmente por dos parámetros: la tasa de crecimiento exponencial y el tiempo de retardo, es decir, el tiempo necesario para adaptarse a las nuevas condiciones. Considerando que un gran número de métodos de alto rendimiento se centran en las mediciones de la tasa de crecimiento, el tiempo de retardo es a menudo un parámetro de vecinos, aunque es el parámetro crucial para la caracterización de la adaptación a las nuevas condiciones. La cuantificación de la adaptación a las condiciones cambiantes que tradicionalmente se ha realizado utilizando métodos manuales laboriosas 3,4. Más recientemente, las técnicas avanzadas se han desarrollado para el análisis de células individuales 5,6. Sin embargo, todavía es difícil distinguir el crecimiento normal después de un retraso en el crecimiento (a saber, un tiempo de retraso) 2,3 de crecimiento lento. Un método automático se construyó, ScanLag 7, adiscriminar entre estos dos fenotipos similares. Un ejemplo notable de la importancia del estudio de la distribución del tiempo de retardo se revela bajo tratamiento con antibióticos. Antibióticos y otros factores de estrés Muchos matan células sólo crecen activamente, y, por lo tanto, las células que están &quot;quedando&quot; están protegidos 8. Para controlar el tiempo de retardo, se puede observar células individuales bajo un microscopio y supervisar el tiempo hasta la primera división. Un inconveniente importante de este método es que el intervalo de tiempo dinámico es limitada; aquellas células que están creciendo temprana cubren la superficie a un ritmo exponencial, disminuyendo eficazmente el crecimiento de las células con un mayor tiempo de retardo. El uso de cámaras de flujo evita algo esta 5, pero un número limitado de células puede ser rastreado y la fracción de bacterias que salen de la fase de latencia después de la mayoría de la población ha comenzado a crecer no puede ser observada. A pesar de estas limitaciones, varios estudios han evaluado la influencia del nivel de diferente hincapié en la distribución del tiempo de demora mediante microscopía de células individuales 9-12. Otra manera de controlar la distribución del tiempo de retraso es a través de las mediciones de turbidez 13,14. Muchas culturas paralelas, cada uno comenzó a partir de una sola célula, se cultivan en un lector de densidad óptica que mide el número de bacterias en la cultura a través del tiempo. Este método está limitado por la precisión de la extrapolación y al número de pozos en una placa. Un método automático fue desarrollado, llamado ScanLag, que permite tiempos de retardo y las distribuciones del tiempo de crecimiento que deben evaluarse, incluso para el pequeño porcentaje de bacterias en una población que tiene tiempos de retardo muy largos. El método se basa en la detección de colonias en placas de agar de nutrientes convencionales 15 (Figura 1). Para automatizar la detección de 16,17 una serie de escáneres comerciales 18 que son dirigidas por el software en casa para adquirir periódicamente las imágenes de las placas, fue diseñado. Software fuediseñado para analizar automáticamente las imágenes y extraer parámetros cuantitativos 19,20, tales como el tiempo de aparición de cada colonia y el crecimiento de tiempo de cada colonia, que se define aquí como el tiempo para crecer a partir de 20 píxeles a 80 píxeles. Aquí presentamos el método en detalle, incluyendo la configuración del sistema y la utilización del software de análisis de imagen automatizado que ha sido mejorado con una mejor interfaz de usuario. Este método puede ser adaptado para medir otras características de colonias, tales como la morfología y color. La medición de estos tipos de parámetros que permitirá el uso del sistema en fenómica multidimensionales. Como el método detecta colonias de células individuales, el sistema puede revelar nuevos fenotipos que no pueden ser medidas por las mediciones de nivel de población. La técnica permite la detección y recuperación de variantes raras, y facilita la detección de rasgos deseados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Difco LB broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 90mm</td>
			<td style="width:71px;">Miniplast</td>
			<td style="width:119px;">20090-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Epson Perfection v37</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B207201</td>
			<td style="width:167px;">Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution:&#160;4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection v200</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B188011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection 3490</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B177011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ADU200 USB Relay</td>
			<td style="width:71px;">ONTRAK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">pieces of sterile black felt cloth</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>approximatly 100 x100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">white plate holders</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface size, with 6 x 99mm diameter hole</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Delerin rings the size of the Petri dish</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">inner diameter: 72 mm 
			outer diameter: 86 mm 
			top outer diameter: 90 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

Como un ejemplo de extracción de distribución del tiempo de retardo, la Figura 5 muestra la capacidad de ScanLag para identificar y realizar un seguimiento de cada colonia con características específicas en una placa con el tiempo, como se haría en un ensayo de cribado. Cuando el cultivo del microorganismo es heterogénea, las diferentes subpoblaciones podrían manifiestan durante el ensayo. Por ejemplo, la Figura 6 muestra la cuantificación apariencia y por lo tanto revela la distribución de tiempo de retardo bimodal en una cepa mutante de E. coli. La tasa de crecimiento de las células influye en el tiempo de aparición de la colonia. Cuando las colonias crecen a la misma tasa, la aparición tardía se puede atribuir a el tiempo de retraso (Figura 7). Para validar que el método de hecho mide el tiempo de retardo de células individuales, se compararon los resultados con los obtenidos ScanLag usando microscopía de una sola célula; esta validación es described en detalle en una publicación previa 7. Este método permite el control de muchas más células que pueden ser evaluadas con el microscopio. Las distribuciones obtenidas mediante microscopía y obtenido usando ScanLag se superponen en gran medida. La distribución ScanLag es ligeramente más amplio; análisis teóricos predicen la ampliación a ser del orden de la desviación estándar de la división de tiempo. Si el tiempo de crecimiento es diferente para cada cepa, el origen del retraso en la aparición debe investigarse más a fondo el uso de otros métodos. Se examinó la influencia de las colonias-primeros que aparecen en la aparición de colonias posteriores. Los experimentos de control 7 confirmaron que el aspecto más adelante no se vio afectada, siempre y cuando el número total de colonias por placa no excedió de 200 (Figura 8). Otro experimento de control confirmó que la ubicación de la colonia en la placa no estaba afectando a su tiempo de aparición 7. El análisis de la pLates está calibrado para umbrales específicos que podrían necesitar modificación dependiendo de los nutrientes presentes en el medio de crecimiento o el tipo de microorganismo. Sin embargo, el análisis es bastante robusto para una gran gama de umbrales tal como se muestra en la Figura 9. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Un diagrama esquemático de los pasos necesarios para crear una distribución aparición de colonias. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Una captura de pantalla del Administrador de dispositivos con los nombres de los escáneres conectados, y del archivo de configuración. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una mayor</a>versión de esta figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Una captura de pantalla del Gestor de Escaneado. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Una captura de pantalla de la ScanLagApp. Una imagen de la placa está en el panel de la izquierda, y las curvas de crecimiento de cada colonia se encuentran en el panel de la derecha, tal como se detalla en el manual. Los picos en algunas de las curvas de la zona de las colonias se producen cuando dos o más colonias se fusionan. Cuando la fusión de colonias sucede, el área de estas colonias es considerado como el área de la articulación. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Un resultado representativo del análisis de una placa. (A) Una imagen de la salida de la aplicación de detección al final del experimento. Cada área de la colonia se identifica, coloreado y le asigna un número de identificación único. Las flechas apuntan a las colonias representativas mide en B. La colonia se detecta basándose en el umbral de intensidad (para colonias de E. coli en agar LB o agar M9 este umbral es de 0,03. Para otros medios de comunicación o las bacterias, este umbral se puede ajustar en función de las ProcessPictures ). Sólo los objetos de más de 10 píxeles se cuentan (este umbral se puede modificar en los MatchColonies de función). La detección de una colonia comienza a las aproximadamente 10 5 bacterias. (B) Parcelas de la zona en píxeles frente al tiempo de cuatro colonias representativas en esta placa. El &quot;tiempo de aparición &#39;de cada colonia es cuando se detecta la colonia. El &quot;tiempo de crecimiento &#39;de cada colonia se define aquí como el tiempo para crecer lado a otrom 20 píxeles a 80 píxeles (esos límites se pueden ajustar mediante la función getAppearanceGrowthByVec). El software no incluye las colonias que se fusionaron antes de alcanzar el límite superior. Identificación de una colonia específica de acuerdo con sus características es fácil gracias al número de identificación y el color asignado a cada colonia. Por ejemplo colonias de # 1, 56, 77 y 124 están destacados en los dos gráficos. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Apariencia cuantificación puede revelar la distribución del tiempo de retraso bimodal. Comparación de histogramas de análisis ScanLag de tiempos de aparición de dos cepas diferentes. Línea azul: cepa de tipo salvaje que crece exponencialmente (Total: 1.320 colonias); línea de alta roja mutante persistencia enriquecido con bacterias rezagadas (Total: 1.529 colonias). (A) histogramas normalizados de apariencia. El picode aparición de células de crecimiento exponencial es el tiempo típico para crecer a una colonia detectable. Recuadro: mismo histograma de la cepa mutante después de restar el tiempo del pico de la cultura exponencial para obtener el tiempo de retraso real en contenedores logarítmicamente espaciados que muestran la distribución del tiempo de retardo bimodal. (B) Función de supervivencia de los mismos datos que en (A) en una escala logarítmica. Esta representación mejora la cola de aparición tardía de la cepa mutante. <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Distribución Apariencia y distribución del tiempo de crecimiento. (A) y (B) muestran dos histogramas dimensionales de la tiempo de aparición y el tiempo de crecimiento de las dos condiciones diferentes (El software excluye colonias que se fusionaron antes de alcanzar el límite superior). (C) comparar los histogramasde las dos cepas muestran la diferencia en el tiempo de aparición, mientras que los tiempos de crecimiento (D) son similares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8. La aparición de las primeras colonias no interfiere con la aparición de colonias posteriores. (A) lag distribución del tiempo de las células de tipo salvaje chapados solo. (B) la zaga distribución del tiempo de una cepa sensible frío solo, después de la transferencia a la temperatura permisiva. (C) lag distribución del tiempo de ambas cepas chapados juntos en las mismas condiciones. La línea de color negro representa la distribución esperada sobre la base de los datos obtenidos en la medición de cada cepa por separado. Un buengreement entre distribuciones esperados y medidos se obtiene siempre y cuando el número total de colonias por placa está por debajo de 200. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. Figura 9 El umbral de detección no afecta a la forma de la distribución aparición de colonias Se analizó la distribución de aparición de colonias para el mismo conjunto de datos utilizando dos tamaños diferentes de umbral; (A) Tamaño de umbral es de 10 píxeles; (B) Tamaño de umbral es de 50 píxeles. Número de células por histograma: aprox. 1500. El umbral de detección resultados diferentes sólo en un cambio del tiempo de detección. <img alt="Figura 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> Figura 10. Temperatura mediciones de estabilidad ACRoss la superficie del escáner. (A) Imagen de un plato con colonias de Bacillus subtilis cultivadas en el escáner sin la administración de energía. La superficie es más caliente en la parte inferior y, por tanto, las colonias crecen más rápido. La línea gradual lado de la placa es una representación esquemática de la gradiente de calor. (B) La estabilidad de la temperatura se midió con dos termopares colocados sobre la superficie del escáner. El escáner se calienta durante cada exploración y en el tiempo. (C) Con la administración de energía, la temperatura es uniforme y las colonias crecen a tasas similares. (D) Igual que (B) con el módulo de gestión de energía. Estabilidad de la temperatura de ± 0.2 ° C. <img alt="Figura 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> Figura 11. Las diferencias en la distribución de la apariencia pueden ser debido a diferencias en los volúmenes de medio sólido. El mismo cultivo bacteriano se sembró en placas con diferentes volúmenes de agar LB, que resulta en una altura diferente de la superficie del agar. Las diferentes alturas llevado a diferentes opacidad de las placas, y por lo tanto un tiempo de detección diferente. Se comprobó la diferencia entre las placas y la diferencia entre diferentes condiciones de altura. (A) las diferencias típicas entre las placas de volúmenes iguales de 30 ± 0,5 ml de LB agar. (B) Diferencia entre las diferentes condiciones de altura: la distribución aspecto se midió para las placas con volúmenes de 20 ± 0,5 ml (rojo), de 30 ± 0,5 ml (verde) y de 40 ± 0,5 ml (azul). Cada condición es el promedio de 6 platos diferentes. Mientras el volumen de las placas está dentro de ± gama 5 ml, la opacidad es similar y da lugar a distribución del tiempo de apariencia similar.

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ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: De Alto Rendimiento La cuantificación del crecimiento de las colonias y Lag Tiempo

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

scanlag-high-throughput-quantification-of-colony-growth-and-lag-time

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K vistas.  The Hebrew University of Jerusalem. ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...