Este protocolo permite una síntesis simple y rápida de nanogotas de perfluorocarbono vaporizadas ópticamente y proporciona un método para mejorar el rendimiento de estas partículas. La versión de persona permite mejorar el contraste simplemente manipulando primero la fase de la imagen de ultrasonido. No requiere equipo adicional y se puede realizar en cualquier sistema de ultrasonido programable.
Comience enjuagando un matraz de fondo redondo de 10 mililitros con cloroformo y lave una jeringa de vidrio hermético al gas de 10 microlitros y un mililitro con cloroformo, aspirando repetidamente el volumen completo de la jeringa y expulsándolo un total de tres veces. Usando las jeringas, agregue 200 microlitros de 25 miligramos por mililitro DSPE-mPEG-2000, ocho microlitros de 10 miligramos por mililitro DSPC y un mililitro de un miligramo por mililitro IR-1048 en el matraz de fondo redondo. Recuerde limpiar las jeringas entre lípidos o tinte para evitar la contaminación en el caldo.
Retire el disolvente utilizando un evaporador rotativo. Asegúrese de que la aspiradora se ajuste lentamente a 332 milibares para evitar golpes. Después de cinco minutos, reduzca la presión a 42 milibares para eliminar cualquier agua que pueda haber entrado en la solución.
Suspenda la torta lipídica en un mililitro de PBS y sonicate o vórtice a temperatura ambiente durante cinco minutos o hasta que toda la torta lipídica haya sido suspendida y disuelta en la solución. Transfiera la solución a un vial de vidrio de siete mililitros y coloque el vial en un plato de vidrio lleno de hielo para permitir que la solución se enfríe durante cinco minutos. Enjuague una jeringa de vidrio hermética al gas con perfluorohexano.
A continuación, añadir 50 microlitros de perfluorohexano al vial utilizando la jeringa. La sonda sonica la mezcla con la amplitud establecida en uno, el tiempo de proceso establecido en 20 segundos, el pulso en un segundo y el pulso apagado en cinco segundos. Luego cambie la configuración como se menciona en el manuscrito de texto y sanice la mezcla una vez más.
Transfiera la solución de nanogotas a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y centrifuga a 300 g durante tres minutos para separar las gotas más grandes que son más de un micrómetro de las gotas más pequeñas. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a otro tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Lave el sobrenadante centrifugando a 3, 000 g durante cinco minutos para granular todas las gotas en la solución.
Vuelva a suspender los PFCnD en un mililitro de PBS pipeteando el pellet hacia arriba y hacia abajo y luego sonicar en un sonicater de baño durante un minuto. Diluya el stock de PFCnDs 100 veces agregando 10 microlitros de PFCnD a 990 microlitros de PBS y sonicate de baño para dispersar los PFCnD antes de medir su tamaño. Mida el tamaño de las gotas utilizando la dispersión dinámica de la luz.
Desgasifique el agua llenando un matraz de vacío de 500 mililitros con 400 mililitros de agua desionizada, selle con un corcho de goma y conecte el matraz a la línea de vacío. Abra la línea de vacío y sumerja el fondo del matraz en el sonicater de baño. Sonicar durante cinco minutos o hasta que no se vea la formación de burbujas de gas.
Prepare 10% de amonio por solución de sulfato disolviendo 500 miligramos en cinco mililitros de agua desgasificada. Agite suavemente la solución si el persulfato de amonio no se disuelve completamente. En un vaso de precipitados de 400 mililitros con una barra de agitación en una placa de agitación, agregue 150 mililitros de agua desgasificada y 50 mililitros de solución de bisacrilamida 40 de acrilamida para formar 200 mililitros de solución de bisacrilamida al 10%.
Revuelva la mezcla a 200 RPM para permitir una mezcla adecuada sin introducir burbujas. Pese 400 miligramos de sílice y agréguela a la solución de bisacrilamida al 10% para formar una solución de sílice y acrilamida al 0,2%. Prepare un molde cuadrado con una inclusión cilíndrica cortando las puntas de una pipeta de transferencia de plástico y apoyándola en el molde con cinta de laboratorio.
Agregue dos mililitros de solución de persulfato de amonio al 10% al vaso de precipitados para obtener una concentración final de 0.1% y agregue 250 microlitros de TEMED a la solución fantasma. Deje que la solución se agite durante menos de un minuto. Vierta rápidamente la solución en el molde teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución.
La solución debe polimerizarse en 10 minutos. Retire el fantasma pasando el extremo plano de una espátula de laboratorio alrededor del borde del molde e invirtiendo el molde. Encienda y caliente el sistema láser pulsado durante aproximadamente 20 minutos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Asegúrese de que el haz de fibra óptica esté conectado correctamente a la salida del láser y que las dos patas estén colocadas correctamente dentro del soporte del haz de fibra. Después de encender el sistema de imágenes de ultrasonido, conecte el transductor de imágenes de matriz al sistema y fije el transductor dentro del soporte para alinear su plano de imágenes con la sección transversal del láser. Ajuste la frecuencia de repetición de pulso del sistema láser a 10 hercios y coloque un medidor de potencia al final del haz de fibras para medir la energía.
Sintoniza el retardo del interruptor Q hasta que la fluencia estimada sea de 70 milijulios por centímetro cuadrado. Rellene uno de los canales en el fantasma de poliacrilamida con el gel de ultrasonido y la mezcla de PFCnD utilizando una jeringa de punta deslizante de plástico de un mililitro. Cubra generosamente la parte superior del canal con gel de ultrasonido y elimine cualquier burbuja con una jeringa de punta deslizante de plástico de un mililitro.
Finalmente, coloque el fantasma de poliacrilamida debajo del transductor y el haz de fibras. La formulación exitosa y la separación centrífuga de los PFCnDs producen gotas de alrededor de 200 a 300 nanómetros de diámetro. El tamaño de las gotitas aumenta con el tiempo debido a la fusión y difusión en un proceso conocido como maduración de Ostwald.
Se encontró que el contraste de la inclusión para el pulso final era aproximadamente 3,2 veces mayor, es decir, una mejora del 220% que el pulso P. El área hiperecoica se calculó para cada fotograma y se normalizó mediante el área hiperecoica del primer fotograma y luego se ajustó a un modelo de decaimiento exponencial. El tiempo de decaimiento característico del área hiperecoica normalizada fue hasta 3,5 veces mayor en las imágenes de N-pulso en comparación con el pulso P.
Los fotogramas de imagen diferencial en modo B se grabaron a tiempo para cada imagen de pulso N y pulso P. Una de las cosas más importantes es expulsar los lípidos en la parte inferior del matraz para asegurarse de que se incorporan correctamente a la torta lipídica.
