Los protocolos son significativos, porque evitan el uso de isótopos radiactivos y eliminan una barrera que puede impedir que muchos trabajadores estudien las enzimas del metabolismo del glucógeno. Los procedimientos descritos son económicos y solo requieren acceso a un espectrofotómetro simple. Para comenzar con la determinación de la actividad de la glucógeno sintasa, descongele las soluciones madre previamente preparadas de glucosa UDP, ATP, fosfoenolpiruvato y NDP quinasa en hielo.
Precaliente un baño de agua a 30 grados centígrados. Cuando las soluciones madre estén listas, prepare suficiente mezcla de ensayo de acuerdo con el número de ensayos de glucógeno sintasa agregando los reactivos a un tubo de 15 mililitros, como se describe en el protocolo de texto. Prepare una reacción en blanco reemplazando el NADH de la mezcla de reacción con el agua y transfiera la reacción a una cubeta de metacrilato desechable.
Utilice la reacción en blanco para establecer cero en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 340 nanómetros. Tome una alícuota de 770 microlitros de la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 mililitros, y agregue secuencialmente dos microlitros de mezcla de quinasa NDP quinasa y piruvato quinasa lactato deshidrogenasa al tubo. Después de mezclar, incubar suavemente el tubo a 30 grados centígrados en el baño de agua durante tres minutos para precalentar la mezcla de reacción.
A continuación, añadir 30 microlitros de la muestra que contiene glucógeno sintasa en tampón Tris 20 milimolares a pH 7,8, y mezclar suavemente antes de transferir la mezcla de reacción a una cubeta de metacrilato de eliminación. Coloque la cubeta en el espectrofotómetro y registre la absorbancia a 340 nanómetros a intervalos cronometrados durante 10 a 20 minutos. Luego, trace las absorbancias obtenidas contra el tiempo.
Para medir la glucosa liberada, transfiera 40 microlitros del sobrenadante de las muestras de glucógeno calentadas a las cubetas de metacrilato desechables. Y agregue los volúmenes medidos de trietanolamina, tampón de sulfato de clorhidrato de magnesio, mezcla de ATP NADP y agua como se describe en el manuscrito. Mezclar la mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente sin crear burbujas de aire.
Agregue 0.5 microlitros de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa a cada cubeta. Después de mezclar por pipeteo, incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego registrar la absorbancia a 340 nanómetros. A continuación, mezcle 0,5 microlitros de hexoquinasa a cada cubeta como se describió anteriormente, e incube durante 15 minutos antes de registrar el conjunto absorbente de 340 nanómetros.
Luego continúe la incubación a temperatura ambiente durante cinco minutos, seguido de registrar la absorbancia. Si la absorción ha aumentado de la registrada a los 15 minutos, continuar la incubación durante cinco minutos antes de registrar la absorción final a 340 nanómetros. Para determinar la ramificación del glucógeno, combine 650 microlitros de reactivo de color de cloruro de calcio y yodo con 100 microlitros de agua en un tubo de 1.5 mililitros, y mezcle bien la solución antes de transferirla a una cubeta de metacrilato desechable.
Coloque la cubeta en el espectrofotómetro para realizar una carrera en un modo de escaneo de longitud de onda para recolectar el espectro de fondo de 330 a 800 nanómetros. En un tubo separado de 1.5 mililitros, combine 650 microlitros del reactivo de color cloruro de calcio de yodo de trabajo con 50 microgramos de glucógeno de ostra y forme el volumen final a 750 microlitros con agua. Después de mezclar bien la mezcla, transfiera la solución a una cubeta de metacrilato desechable para recolectar un espectro de absorción de 330 a 800 nanómetros.
Del mismo modo, obtenga un espectro de absorción con 50 microgramos de amilopectina y 30 microgramos de amilosa como se describió anteriormente. Para obtener una indicación de la estructura ramificada de una muestra de glucógeno no caracterizada, combine de 25 a 50 microgramos del glucógeno con 650 microlitros del reactivo de color cloruro de calcio de yodo en funcionamiento, y proceda como se explicó anteriormente para adquirir el espectro de absorción. En los ensayos de glucógeno sintasa, se observó una disminución lineal en la absorción a 340 nanómetros con el tiempo.
Agregar demasiada glucógeno sintasa al ensayo causó que la reacción llegara a completarse en los primeros dos minutos. La reacción de control, que no contenía glucógeno sintasa, no mostró una disminución mensurable en la absorbancia. Los datos de un ensayo de glucógeno fosforilasa utilizando una enzima purificada tuvieron una fase lineal que duró tres minutos.
Una tasa de aumento de la absorbancia de alrededor de 0,01 a 0,04 unidades por minuto es óptima. En el ensayo de la enzima de desramificación del glucógeno, la reacción mostró una fase lineal que persistió durante al menos 10 minutos. Los datos representativos de los ensayos de enzimas de ramificación de glucógeno mostraron la diferencia en la absorbancia entre las muestras de control que carecían de enzima ramificada y las reacciones que contenían enzima ramificada.
Se ilustra el estrecho rango dinámico del ensayo. El cambio máximo en la absorbancia que se puede producir es de 0,4 unidades de absorbancia, y la linealidad se pierde cuando el cambio en la absorción es de aproximadamente 0,2 unidades de absorbancia. Las masas de glucógeno, amilopectina y amilosa utilizadas en la evaluación de ramificación del glucógeno mostraron una lectura de absorbancia máxima de alrededor de 0,7 a 0,8, cada una con diferentes máximos de absorbancia.
La muestra de glucógeno produjo dos picos a aproximadamente 400 nanómetros y 460 nanómetros. El reactivo de color cloruro de calcio yodo es muy denso. Es importante asegurarse de que las muestras de glucógeno estén completamente mezcladas con el reactivo antes de recolectar un espectro de absorción.
