البروتوكولات مهمة ، لأنها تتجنب استخدام النظائر المشعة وتزيل حاجزا قد يمنع العديد من العمال من دراسة إنزيمات استقلاب الجليكوجين. الإجراءات الموصوفة غير مكلفة ، ولا تتطلب سوى الوصول إلى مقياس الطيف الضوئي البسيط. للبدء في تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين ، قم بإذابة محاليل المخزون المعدة مسبقا من الجلوكوز UDP و ATP و phosphoenolpyruvate و NDP kinase على الجليد.
قبل تسخين حمام مائي إلى 30 درجة مئوية. عندما تكون محاليل المخزون جاهزة ، قم بإعداد خليط فحص كاف وفقا لعدد مقايسات سينسيز الجليكوجين عن طريق إضافة الكواشف إلى أنبوب 15 ملليلتر ، كما هو موضح في بروتوكول النص. تحضير تفاعل فارغ عن طريق استبدال NADH من خليط التفاعل بالماء ، ونقل التفاعل إلى كوفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منه.
استخدم التفاعل الفارغ لتعيين صفر على مقياس الطيف الضوئي عند الطول الموجي 340 نانومتر. خذ حصة 770 ميكرولتر من خليط التفاعل في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف بالتتابع اثنين ميكرولتر من كل من خليط نازعة هيدروجين كيناز NDP وبيروفات كيناز لاكتات إلى الأنبوب. بعد الخلط ، احتضن الأنبوب برفق عند 30 درجة مئوية في حمام مائي لمدة ثلاث دقائق لتسخين خليط التفاعل.
ثم أضف 30 ميكرولتر من العينة التي تحتوي على سينسيز الجليكوجين في محلول تريس 20 مليمولار عند درجة الحموضة 7.8 ، واخلطها برفق قبل نقل خليط التفاعل إلى كوفيت ميثاكريليت للتخلص منه. ضع الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي ، وسجل الامتصاص عند 340 نانومتر على فترات زمنية محددة لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ثم ، ارسم الامتصاص الذي تم الحصول عليه مقابل الوقت.
لقياس الجلوكوز المنطلق ، انقل 40 ميكرولترا من المادة الطافية من عينات الجليكوجين المسخنة إلى كوفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منها. وأضف الأحجام المقاسة من ثلاثي إيثانولامين ، ومحلول كبريتات المغنيسيوم الهيدروكلوريد ، وخليط NADP ATP والماء كما هو موضح في المخطوطة. امزج الخليط عن طريق السحب لأعلى ولأسفل برفق دون تكوين فقاعات هواء.
أضف 0.5 ميكرولتر من نازعة هيدروجين الجلوكوز 6 فوسفات إلى كل كوفيت. بعد الخلط عن طريق السحب ، احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم سجل الامتصاص عند 340 نانومتر. بعد ذلك ، امزج 0.5 ميكرولتر من الهيكسوكيناز مع كل كوفيت كما هو موضح سابقا ، واحتضانه لمدة 15 دقيقة قبل تسجيل المجموعة الماصة 340 نانومتر.
ثم استمر في الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، متبوعا بتسجيل الامتصاص. إذا زاد الامتصاص عن ذلك المسجل في 15 دقيقة ، استمر في الحضانة لمدة خمس دقائق قبل تسجيل الامتصاص النهائي عند 340 نانومتر. لتحديد تفرع الجليكوجين ، امزج 650 ميكرولتر من مخزون كاشف لون كلوريد الكالسيوم اليود مع 100 ميكرولتر من الماء في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، واخلط المحلول جيدا قبل نقله إلى كوفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منه.
ضع الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي لإجراء تشغيل في وضع مسح الطول الموجي لجمع طيف الخلفية من 330 إلى 800 نانومتر. في أنبوب منفصل 1.5 ملليلتر ، يمزج 650 ميكرولتر من كاشف لون كلوريد الكالسيوم اليود العامل مع 50 ميكروغرام من جليكوجين المحار ، ويشكل الحجم النهائي إلى 750 ميكرولتر بالماء. بعد مزج الخليط جيدا ، انقل المحلول إلى كفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منه لجمع طيف امتصاص من 330 إلى 800 نانومتر.
وبالمثل ، احصل على طيف امتصاص يحتوي على 50 ميكروغرام من الأميلوبكتين و 30 ميكروغرام من الأميلوز كما هو موضح من قبل. للحصول على إشارة إلى البنية المتفرعة لعينة الجليكوجين غير المميزة ، ادمج 25 إلى 50 ميكروغرام من الجليكوجين مع 650 ميكرولتر من كاشف لون كلوريد الكالسيوم باليود العامل ، وتابع كما هو موضح سابقا للحصول على طيف الامتصاص. في مقايسات سينسيز الجليكوجين ، لوحظ انخفاض خطي في الامتصاص عند 340 نانومتر بمرور الوقت.
أدت إضافة الكثير من سينسيز الجليكوجين إلى الفحص إلى اكتمال التفاعل خلال أول دقيقتين. لا يظهر تفاعل التحكم ، الذي لا يحتوي على سينثيز الجليكوجين ، أي انخفاض قابل للقياس في الامتصاص. البيانات من مقايسة فسفوريلاز الجليكوجين باستخدام إنزيم منقى لها طور خطي يستمر لمدة ثلاث دقائق.
معدل زيادة الامتصاص من حوالي 0.01 إلى 0.04 وحدة في الدقيقة هو الأمثل. في مقايسة إنزيم إزالة التفرع الجليكوجين ، أظهر التفاعل طورا خطيا يستمر لمدة 10 دقائق على الأقل. أظهرت البيانات التمثيلية من مقايسات الإنزيم المتفرع للجليكوجين الفرق في الامتصاص بين عينات التحكم التي تفتقر إلى الإنزيم المتفرع ، والتفاعلات التي تحتوي على إنزيم متفرع.
يتم توضيح النطاق الديناميكي الضيق للفحص. الحد الأقصى للتغير في الامتصاص الذي يمكن إنتاجه هو 0.4 وحدة امتصاص ، وتفقد الخطية عندما يكون التغيير في الامتصاص حوالي 0.2 وحدة امتصاص. أظهرت كتل الجليكوجين والأميلوبكتين والأميلوز المستخدمة في تقييم تفرع الجليكوجين قراءة امتصاص قصوى تبلغ حوالي 0.7 إلى 0.8 ، كل منها عند حد أقصى امتصاص مختلف.
أنتجت عينة الجليكوجين قمتين عند حوالي 400 نانومتر و 460 نانومتر. كاشف لون كلوريد الكالسيوم اليود كثيف للغاية. من المهم التأكد من خلط عينات الجليكوجين بالكامل مع الكاشف قبل جمع طيف الامتصاص.
