Протоколы важны, потому что они избегают использования радиоактивных изотопов и устраняют барьер, который может помешать многим работникам изучать ферменты метаболизма гликогена. Описанные процедуры недороги, требуя только доступа к простому спектрофотометру. Чтобы начать с определения активности гликогенсинтазы, разморозьте на льду ранее приготовленные исходные растворы UDP глюкозы, АТФ, фосфоэнолпирувата и NDP-киназы.
Предварительно нагрейте водяную баню до 30 градусов цельсия. Когда исходные растворы будут готовы, приготовьте достаточную пробирную смесь в соответствии с количеством анализов гликогенсинтазы, добавив реагенты в 15-миллилитровую трубку, как описано в текстовом протоколе. Приготовьте пустую реакцию, заменив NADH из реакционной смеси водой, и перенесите реакцию в одноразовую метакрилатную кювету.
Используйте пустую реакцию, чтобы установить ноль на спектрофотометре на длине волны 340 нанометров. Возьмите одну аликвоту 770 микролитров реакционной смеси в 1,5-миллилитровой трубке и последовательно добавьте в пробирку по два микролитра смеси NDP-киназы и пируваткиназы лактатдегидрогеназы. После перемешивания аккуратно инкубируйте трубку при температуре 30 градусов Цельсия на водяной бане в течение трех минут, чтобы предварительно прогреть реакционную смесь.
Затем добавляют 30 микролитров образца, содержащего гликогенсинтазу, в 20-миллимолярный буфер Триса при рН 7,8 и аккуратно перемешивают перед переносом реакционной смеси в утилизационную метакрилатную кювету. Поместите кювету в спектрофотометр и запишите поглощение на 340 нанометров с временными интервалами в течение 10-20 минут. Затем нанесите график поглощений, полученных против времени.
Чтобы измерить высвобождаемую глюкозу, перенесите 40 микролитров супернатанта из нагретых образцов гликогена в одноразовые метакрилатные кюветы. И добавьте измеренные объемы триэтаноламина, гидрохлоридно-магниевого сульфатного буфера, смеси NADP ATP и воды, как описано в рукописи. Перемешайте смесь, аккуратно пипетируя вверх и вниз, не создавая пузырьков воздуха.
Добавьте 0,5 микролитра глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы к каждой кювете. После перемешивания путем пипетки инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем регистрируют поглощение на 340 нанометров. Затем смешайте 0,5 микролитра гексокиназы с каждой кюветой, как описано ранее, и инкубируйте в течение 15 минут перед записью абсорбирующего набора 340 нанометров.
Затем продолжают инкубацию при комнатной температуре в течение пяти минут с последующей записью поглощения. Если поглощение увеличилось по сравнению с тем, которое было зарегистрировано через 15 минут, продолжайте инкубацию в течение пяти минут, прежде чем регистрировать окончательное поглощение на 340 нанометров. Чтобы определить разветвление гликогена, соедините 650 микролитров цветного реагента йода хлорида кальция со 100 микролитрами воды в трубке объемом 1,5 миллилитра и тщательно перемешайте раствор перед переносом в одноразовый метакрилатный кювет.
Поместите кювету в спектрофотометр для проведения пробега в режиме сканирования длины волны для сбора фонового спектра от 330 до 800 нанометров. В отдельной 1,5-миллилитровой трубке соединить 650 микролитров рабочего цветного реагента йода хлорида кальция с 50 мкг устричного гликогена, и составить конечный объем до 750 микролитров с водой. После тщательного смешивания смеси переложите раствор в одноразовую метакрилатную кювету для сбора спектра поглощения от 330 до 800 нанометров.
Аналогично, получите спектр поглощения с 50 микрограммами амилопектина и 30 микрограммами амилозы, как описано ранее. Чтобы получить указание на разветвленную структуру нехарактеризованного образца гликогена, соедините от 25 до 50 мкг гликогена с 650 микролитрами рабочего цветового реагента хлорида кальция йода и приступайте, как объяснялось ранее, к приобретению спектра поглощения. В анализах гликогенсинтазы наблюдалось линейное снижение абсорбции на 340 нанометров с течением времени.
Добавление слишком большого количества гликогенсинтазы в анализ привело к тому, что реакция достигла завершения в течение первых двух минут. Контрольная реакция, которая не содержала гликогенсинтазы, не показала измеримого снижения абсорбции. Данные анализа гликогенфосфорилазы с использованием очищенного фермента имели линейную фазу, длящуюся в течение трех минут.
Скорость увеличения поглощения от 0,01 до 0,04 единицы в минуту является оптимальной. В анализе гликогена, де-ветвящегося фермента, реакция показала линейную фазу, сохраняющуюся в течение, по меньшей мере, 10 минут. Репрезентативные данные анализов ферментов ветвления гликогена показали разницу в абсорбции между контрольными образцами, в которых отсутствовал ветвящийся фермент, и реакциями, содержащими ветвящийся фермент.
Проиллюстрирован узкий динамический диапазон анализа. Максимальное изменение поглощения, которое может быть произведено, составляет 0,4 единицы поглощения, а линейность теряется, когда изменение поглощения составляет приблизительно 0,2 единицы поглощения. Массы гликогена, амилопектина и амилозы, используемые в оценке ветвления гликогена, показали максимальное показание абсорбции от 0,7 до 0,8, каждый при разных максимумах абсорбции.
Образец гликогена произвел два пика примерно на 400 нанометров и 460 нанометров. Цветной реагент хлорида йода очень плотный. Важно убедиться, что образцы гликогена полностью смешаны с реагентом до сбора спектра поглощения.
