Este método de aislamiento de células endoteliales retinianas permitirá técnicas avanzadas de secuenciación para revelar nuevos mecanismos de desarrollo vascular. El protocolo descrito está optimizado para altos grados de viabilidad y pureza, que son esenciales para las aplicaciones de secuenciación de próxima generación. Demostrando el procedimiento estará Shelby Cain, una estudiante graduada del Laboratorio Hershey.
Comience a extraer los ojos del ratón neonatal sacrificado cortando la piel y la membrana sobre el ojo con una incisión perpendicular al párpado con tijeras de disección. Luego use los fórceps para presionar hacia abajo por encima y por debajo del ojo para que el ojo se mueva fuera de la cavidad. Pellizque cuidadosamente debajo del ojo con los fórceps y corte el nervio óptico que mantiene el ojo unido.
Luego coloque ambos ojos del ratón en un pocillo de la placa de 48 pocillos en el PBS helado recién preparado hasta que termine de cosechar. Para aislar el tejido retiniano del ratón, suspenda los ojos en la almohadilla de disección en una placa de Petri llena de 500 microlitros de PBS helado usando una almohadilla de tubo de transferencia con una punta ancha. Trabajando bajo el microscopio de disección, sostenga el nervio óptico con un fórceps fino y use los segundos fórceps para perforar el orificio a través de la cámara anterior del ojo donde se conectan la córnea y la esclerótica.
Luego rasgue el agujero en un círculo alrededor del 75% del camino alrededor de la córnea. Mientras sostiene el nervio óptico con un fórceps, use el segundo fórceps para arrancar suavemente la esclerótica y el cuerpo vítreo del tejido retiniano. Para extraer el cristalino y los vasos del plexo hialoide, meta la retina con fórceps abiertos hasta casi tocarlo y luego cierre los fórceps para agarrar y sacar el cristalino y los vasos del plexo hialoide de la retina.
Cuando se retiren todos los vasos, coloque las retinas en los tubos de microcentrífuga de dos mililitros llenos con 500 microlitros de un PBS helado. Retire el exceso de PBS del tubo de microcentrífuga de dos mililitros con una pipeta dejando aproximadamente 100 microlitros de PBS en el tubo para cubrir completamente el tejido retiniano. Luego agregue 500 microlitros de la solución de digestión recién preparada al tubo.
Use una pipeta P1000 y una punta de pipeta para pipetear hacia arriba y hacia abajo del tejido retiniano en la solución de digestión cinco veces. Cuando haya terminado, incube la mezcla de digestión en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos con pipeteo de la mezcla de digestión hacia arriba y hacia abajo cada cinco minutos como se explicó anteriormente. Después de la incubación, el tejido retiniano se disolverá en una suspensión de una sola célula haciendo que la mezcla de digestión se vuelva turbia.
A continuación, granular las células por centrifugación a 375 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, retire el PBS del pellet de células lavadas mediante pipeteo y luego inmunotiñe las células resuspendiendo el pellet en 100 microlitros de solución de tinción de anticuerpos por 0.5 veces 10 a la sexta celda. Incubar la suspensión unicelular con la solución de tinción de anticuerpos durante 30 minutos en hielo en la oscuridad con golpeteo del tubo cada 10 minutos para mezclar suavemente las células.
Para la clasificación celular activada por fluorescencia, granular las células por centrifugación a 375 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de quitar el sobrenadante, lave y granule las células en 500 microlitros de PBS como se describió anteriormente. Y luego resuspender las células en 300 microlitros de clasificación celular activada por fluorescencia o tampón FACS mezclando suavemente con la pipeta.
A continuación, agregue yoduro de propidio o PI como marcador de viabilidad a los tubos de muestra que contienen el tampón FACS para obtener una concentración final de 0,5 microgramos por mililitro. Use una pipeta para transferir las suspensiones celulares a través de una tapa de presión del filtro celular que contenga un filtro de 35 micras en un tubo de ensayo de cinco mililitros. Después de la filtración, mantenga el tubo FACS en hielo en la oscuridad y luego transfiera el tubo al clasificador de células.
Encienda el instrumento FACS y el ordenador y abra el software FACS para ejecutar y utilizar el instrumento FACS. Realizar pruebas rutinarias de control de calidad. Cargue las muestras de manchas de control en el instrumento FACS para ajustar los ejes.
Comience con células de anticuerpos IgG solo para generar y ajustar la dispersión hacia adelante y la dispersión lateral. Luego CD31 anticuerpo sólo para generar y ajustar CD31. Y luego el anticuerpo CD45 solo para generar y ajustar CD45.
Registre los datos de las muestras de control. A continuación, cargue las células de muestra teñidas en el instrumento FACS y ejecute la muestra. Camine las celdas en función de la dispersión directa o FSC y los parámetros de dispersión lateral o SSC.
Células de la marcha por FSCA y FSCH para identificar dobletes celulares y solo recolectar células individuales. Células de la marcha por PI y SSCA para identificar células viables. Hacer una marcha CD31+CD45 con controles Hacer una marcha CD31+CD45 con controles y andar las células por CD31 y CD45.
Inserte un tubo de recolección con 250 microlitros de tampón FACS en el instrumento. A continuación, comience a clasificar las células CD31 + CD45 en el tubo de recolección instalado. Mantenga los tubos de recolección en hielo para su posterior análisis.
Las muestras se pueden procesar para aplicaciones de secuenciación de próxima generación. En el estudio, variar el tiempo de digestión afectó el rendimiento celular y el porcentaje de viabilidad. El tiempo de digestión de 20 minutos resultó en un rendimiento óptimo con un bajo porcentaje de células endoteliales no viables.
La posterior tinción de yoduro de propidio demostró que las células endoteliales aisladas permanecieron viables durante 60 minutos después del aislamiento. La pureza de la población celular se evaluó mediante el análisis cuantitativo de PCR o qPCRR de la expresión de genes de células endoteliales que muestran un fuerte enriquecimiento de los genes de células endoteliales en la población CD31+CD45. Purificación de ARN de las células endoteliales aisladas convirtiendo y amplificando el ADNc a través de la preparación y secuenciación de la biblioteca La biblioteca de ADNc dio como resultado más de 16.000 genes identificados en nueve muestras independientes.
Se observó una caída en las transcripciones por millón de lecturas o TPM en genes por debajo de este umbral. La secuenciación de ARN unicelular de las células endoteliales retinianas aisladas a través de la tubería de genómica 10x dio como resultado una mediana de 1, 171 genes por célula, 15, 247 genes totales detectados y una mediana de 2, 255 identificadores moleculares únicos o recuentos UMI por célula en 917 células. Los pasos críticos en este protocolo son el aislamiento del tejido retiniano y la digestión de tejidos, que deben realizarse con precisión como se describe para optimizar el rendimiento y la viabilidad celular.
Las células endoteliales aisladas se pueden utilizar en técnicas avanzadas de secuenciación, como la secuenciación de ARN del transcriptoma completo, la secuenciación de ARN de una sola célula, la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina y el ensayo para la secuenciación de cromatina accesible a transposasa. El uso de este método optimizado en combinación con métodos de secuenciación de próxima generación y mediante enfoques computacionales puede dilucidar aún más los mecanismos de las vías de señalización interconectadas que regulan los desarrollos vasculares.
