Este protocolo describe un método simple y eficiente para diferenciar las IPC humanas en organoides neuroretinianos tridimensionales complejos para investigación y aplicaciones regenerativas. Esta técnica involucra cultivos adherentes y en suspensión, lo que permite la recolección selectiva y el enriquecimiento tanto de organoides retinianos como de células RP. Puede ofrecer un suministro viable y regular de fuentes celulares para desarrollar terapias basadas en células para enfermedades degenerativas de la retina.
Tales organoides retinianos derivados de células madre y células RPE son útiles como modelos in vitro para estudiar el desarrollo ocular y las enfermedades retinianas hereditarias. Este método puede ser fácilmente replicado por laboratorios de investigación que ya están familiarizados con el manejo de cultivos humanos IPSC. La demostración visual apoya en gran medida la identificación de los campos oculares y el aislamiento de las copas neurorretinianas en función de su posicionamiento espacial y características morfológicas.
Para comenzar, aspirar el medio gastado de 70 a 80% de cultivos humanos confluentes de IPSC en placas de seis pocillos. Agregue PBS a los pocillos, revuélvalos y aspire el tampón de lavado. Luego agregue un mililitro de solución de disociación celular o CDS a cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante cinco a siete minutos hasta que las células se redondeen.
Aspire el CDS y recoja la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Gire el tubo a 1.000 RPM durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1,2 mililitros de Essential 8 medium.
Dispense 200 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de seis pocillos recubierta de matriz que contenga 1,5 mililitros de medio de cultivo IPSC y 10 micromolares Y27632. Después de 12 a 24 horas, retire el medio gastado y agregue el medio de ascensión completa precalentado sin Y27632 para mantener los cultivos. Cambiar el medio de cultivo cada 24 horas hasta que los cultivos alcancen el 70 al 80% de confluencia.
En el día cero, aspire el medio de mantenimiento IPSC humano y agregue un medio de inducción de diferenciación que contenga un nanogramo por mililitro BFGF y un nanogramo por mililitro Noggin a la placa de seis pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. El primer día, aspire el medio gastado y agregue un medio de inducción de diferenciación que contenga un nanogramo por mililitro BFGF y 10 nanogramos por mililitro Noggin.
Incubar las células de nuevo a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. En el día dos y tres, retire el medio gastado y agregue un medio de inducción de diferenciación que contenga 10 nanogramos por mililitro de Noggin. Después de agregar dos mililitros por pozo mediano a una placa de seis pocillos, incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% y cambiar el medio cada 24 horas.
En el cuarto día, retire el medio gastado y agregue el medio de diferenciación retiniana o RDM. Siga el mismo procedimiento para agregar dos mililitros por pozo mediano a una placa de seis pocillos e incubar los cultivos. Cambia el medio todos los días.
Alrededor de los días 14 y 18, observe los cultivos bajo un microscopio con un aumento de 10X para la aparición de dominios en forma de roseta neural que consisten en progenitores tempranos del campo ocular. Alrededor de los días 21 y 28, observe los cultivos bajo un microscopio con un aumento de 4X y 10X para observar la aparición de EFP distintos autoorganizados con una isla central de estructuras neuroretinianas circulares 3D rodeadas de excrecencias contiguas de epitelio neuro y epitelio de superficie ocular. Tome una pipeta Pasteur estéril y sostenga la base en una mano y la punta capilar en la otra.
Esterilice a la llama y caliente la región cerca de la mitad de la punta capilar con movimientos de rotación hasta que el vidrio se vuelva flexible. Luego aléjese de la llama y tire rápidamente de la punta capilar hacia afuera para crear una punta capilar fina con una luz cerrada. Sostenga la punta fina horizontalmente frente a la llama y pásela rápidamente a través de la llama en un movimiento hacia afuera para crear un gancho suave o una punta capilar en forma de L.
Bajo un microscopio estéreo, elija manualmente las copas neuroretinianas bien formadas de los EFP individuales utilizando la zona de curvatura externa lisa del gancho capilar como una cuchara fina. En los días 25 y 30, añadir cuatro mililitros de medio de diferenciación retiniana precalentado en una placa de 60 milímetros de baja fijación al cultivo y mantener las copas retinianas para generar organoides retinianos 3D. Esto debe hacerse antes de cosechar las copas neuro retinianas.
Coloque una micropipeta de un milímetro para aspirar 100 microlitros y use micropuntas de un mililitro con aberturas de diámetro ancho para aspirar y transferir las copas retinianas flotantes a los platos frescos de cultivo de baja adherencia preparados anteriormente. Mantener las copas retinianas en RDM como cultivos de suspensión no adherentes e incubarlas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. En los días 30 y 45, siguiendo un método de alimentación parcial, retire la mitad del volumen del medio gastado y reemplácelo con un volumen igual de medio fresco.
En los días 45 y 60, cultivar los organoides retinianos durante otras dos semanas en RDM que contienen 100 taurina micromolar para apoyar una mejor supervivencia y diferenciación del linaje de los progenitores neuroretinianos y el desarrollo de tipos de células retinianas maduras. Los organoides retinianos se caracterizan en diferentes etapas de maduración para la expresión de varios marcadores progenitores retinianos mediante RT-PCR e inmunohistoquímica. Los resultados de la RT-PCR confirmaron la inducción y expresión de marcadores neuroretinianos en organoides retinianos de un mes de edad y organoides retinianos de dos meses de edad.
Aquí se muestran las imágenes confocales de secciones inmunomarcadas de organoides retinianos inmaduros que utilizan anticuerpos contra los marcadores progenitores neuroretinianos Chx10, PAX6 y Otx2, y organoides retinianos maduros que utilizan anticuerpos contra los marcadores precursores fotorreceptores recoverin y CRX. La marcada capa más externa de los organoides retinianos con células fotorreceptoras diferenciadoras se amplía y se muestra en estas imágenes. Las rudimentarias extensiones internas en forma de segmento están marcadas por flechas blancas.
Los grupos de EFP con la copa neuroretiniana en el centro y las excrecencias migratorias de RPE muestran pigmentación a lo largo de los bordes delanteros. Aquí se muestran excrecencias epiteliales pigmentadas bien diferenciadas de múltiples EFP alrededor de la isla neuroretiniana. Un mayor aumento de un EFP muestra la zona migratoria de los progenitores del EPR y el epitelio de la superficie ocular que rodea una copa neuroretiniana.
Aquí se muestran cultivos adherentes extendidos que desarrollaron monocapas de células RPE inmaduras que contienen células pigmentadas y no pigmentadas. Los cultivos monocapa de células RPE completamente maduras y pigmentadas muestran morfología de adoquines en el día 60. Las células RPE que expresan PAX6, MITF y RPE65 se muestran en esta figura.
Estas imágenes representan EFPs con agregados anormales de progenitores retinianos con laminación distorsionada y ausencia de estrías. EFP con la copa neuroretiniana en miniatura, pero que carece de la zona circundante del EPR y el epitelio de la superficie ocular se muestran en esta figura. La imagen representativa muestra agregados neuroretinianos irregulares formados en el cultivo en suspensión.
Es muy importante comenzar el proceso de diferenciación utilizando cultivos de IPC de crecimiento casi confluentes para lograr una inducción eficiente de los campos oculares dentro de tres a cuatro semanas. Los organoides retinianos y las células del EPR generadas a partir de IPC normales y específicas del paciente se pueden utilizar como modelos de enfermedades de la retina y para probar nuevos fármacos terapéuticos.
