Estos protocolos sirven como pautas de mejores prácticas para la generación de polvo óseo para su uso en la extracción de ADN aguas abajo en una variedad de elementos esqueléticos. Hay algunos protocolos de muestreo de ADN antiguo publicados para lugares distintos de la dentina y la pirámide petrosa. Hoy, mostraremos los métodos de muestreo detallados para tres alternativas.
Estos métodos también muestran un gran potencial para su uso con restos forenses degradados, pero también como línea de base para desarrollar técnicas similares con especímenes no humanos. Realice todas las tomas de muestras en una sala limpia dedicada, bajo una campana de PCR equipada con luz UV o un gabinete de bioseguridad. Apague el flujo de aire y extienda papel de aluminio estéril a través de la parte superior del banco para atrapar cualquier polvo o fragmento de hueso perdido.
Coloque una hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estéril. Sostenga el molar descontaminado por el esmalte con la raíz hacia abajo sobre una bandeja de pesaje, usando una abrazadera de mano. Equipe un taladro dental con una rueda de corte circular con bordes de diamante.
Con el taladro ajustado a un ajuste de velocidad media, toque ligeramente el borde del taladro hasta la raíz en un ángulo de aproximadamente 20 grados. Raspa la muestra hacia abajo en la bandeja para recoger el material amarillo más externo de la raíz. Detenga la recolección una vez que el material más ligero de la dentina se haga visible.
Transfiera el polvo a un tubo LoBind Safe-Lock de dos mililitros y registre esta masa de polvo recolectada utilizando una balanza cerrada con una precisión de al menos 0.01 miligramos. Transfiera el polvo del papel de pesaje a un tubo LoBind Safe-Lock de dos mililitros para su extracción. Guarde este tubo a 20 grados centígrados.
Asegúrese de recuperar todos los fragmentos óseos y la mayor cantidad de polvo posible. Cambie la lámina entre cada muestreo, desechando la lámina usada en una bolsa de riesgo biológico en autoclave. Descontamine el área de trabajo y extienda papel de aluminio estéril por la parte superior del banco cada vez antes de pasar al siguiente hueso.
Coloque una pequeña hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estándar. Retire y deseche la capa más externa del hueso cortical del arco vertebral superior con un taladro dental. Luego, asegure las vértebras en una abrazadera de mano, con el proceso espinoso hacia afuera y el aspecto superior hacia abajo.
Mientras sostiene la vértebra, perfore hacia arriba en el centro de la muesca en forma de V, formada por la fusión del proceso espinoso con las laminillas con baja velocidad y alto torque. Deje de perforar cuando haya una caída notable en la resistencia. Cambie ligeramente la posición de perforación y repita hasta que se recojan de 50 a 100 miligramos de polvo óseo.
Transfiera el polvo óseo del papel de pesaje a un tubo LoBind de dos mililitros para su extracción y guárdelo a 20 grados centígrados. Asegúrese de que se recuperen todos los fragmentos óseos y la mayor cantidad de polvo posible antes de desechar una lámina. Descontamine el área de trabajo y prepárese para la recolección de muestras, como se describió anteriormente.
Coloque una pequeña hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estándar. Sostenga la cúpula del astrágalo hacia arriba, y la superficie medial hacia el colector, sobre la bandeja de pesaje. Raspa el hueso cortical a una profundidad de aproximadamente un milímetro desde el cuello del astrágalo usando un taladro dental con una broca de bajo calibre ajustada a baja velocidad y alto torque.
Cambie la posición de perforación y repita esto hasta que se recojan aproximadamente de 50 a 100 miligramos de polvo óseo. Transfiera este polvo óseo del papel de pesaje a un tubo LoBind de dos mililitros para su extracción. Guarde el polvo a 20 grados centígrados indefinidamente.
Almacene el hueso restante y el exceso de polvo en un ambiente estéril seco y con temperatura controlada a 25 grados centígrados. Deseche todos los residuos en bolsas o recipientes de riesgo biológico para autoclave. Esterilice o descontamine todo el equipo reutilizable y exponerlo a los rayos UV entre cada muestreo.
La Pars petrosa produjo ADN endógeno más alto que los otros 23 lugares de muestreo anatómico estudiados. Las siete ubicaciones adicionales de muestreo anatómico presentadas en este protocolo produjeron los siguientes rendimientos más altos. Las ubicaciones alternativas produjeron consistentemente rendimientos de ADN adecuados para los análisis genéticos de poblaciones estándar.
Las tasas de duplicación en las bibliotecas derivadas de todas las ubicaciones de muestreo anatómico fueron bajas, lo que indica una alta complejidad. Los dientes, así como las vértebras torácicas mostraron una recuperación molecular adecuada. Uno de los aspectos más desafiantes del muestreo óseo es el proceso de perforación, como cómo sostener un taladro, dónde perforar y cuándo detener la perforación.
