이러한 프로토콜은 다양한 골격 요소에 걸친 다운스트림 DNA 추출에 사용하기 위한 뼈 분말 생성에 대한 모범 사례 지침으로 사용됩니다. 상아질과 소피라미드 이외의 위치에 대해 발표된 고대 DNA 샘플링 프로토콜이 몇 가지 있습니다. 오늘은 세 가지 대안에 대한 자세한 샘플링 방법을 보여 드리겠습니다.
이러한 방법은 또한 분해된 법의학 유해와 함께 사용할 수 있는 큰 잠재력을 보여줄 뿐만 아니라 비인간 표본으로 유사한 기술을 개발하기 위한 기준선으로도 사용됩니다. UV 조명이 장착된 PCR 후드 또는 생물안전 캐비닛 아래의 전용 클린룸에서 모든 샘플링을 수행합니다. 공기 흐름을 끄고 멸균 알루미늄 호일을 벤치 상단에 펴서 흩어진 뼈 가루나 파편을 잡습니다.
계량 용지 한 장을 멸균 계량 트레이에 넣습니다. 휴대용 클램프를 사용하여 뿌리가 칭량 트레이 위를 향하도록 에나멜로 오염 제거 된 어금니를 잡습니다. 치과 용 드릴에 다이아몬드 가장자리 원형 커팅 휠을 장착하십시오.
드릴을 중간 속도 설정으로 설정한 상태에서 드릴 가장자리를 약 20도 각도로 뿌리까지 가볍게 터치합니다. 샘플을 트레이 아래쪽으로 긁어 뿌리에서 가장 바깥쪽에 있는 노란색 재료를 수집합니다. 상아질의 더 가벼운 물질이 보이면 수집을 중지하십시오.
분말을 2 밀리리터 LoBind Safe-Lock 튜브로 옮기고 최소 0.01 밀리그램의 정확도로 밀폐 된 저울을 사용하여 수집 된 분말 질량을 기록합니다. 추출을 위해 계량 용지에서 2밀리리터 LoBind 안전 잠금 튜브로 분말을 옮깁니다. 이 튜브를 섭씨 20도에서 보관하십시오.
모든 뼈 조각과 가능한 한 많은 분말을 회수하십시오. 각 샘플링 사이에 호일을 교체하고 사용한 호일을 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백에 폐기합니다. 작업 영역의 오염을 제거하고 다음 뼈로 이동하기 전에 매번 벤치 상단에 멸균 알루미늄 호일을 펼칩니다.
작은 계량 용지를 표준 계량 트레이에 넣습니다. 치과 드릴을 사용하여 상 척추 궁의 피질 뼈의 가장 바깥 쪽 층을 제거하고 폐기하십시오. 그런 다음 척추를 핸드 클램프에 고정하고 가시 돌기를 바깥쪽으로 향하게하고 상반을 아래로 향하게합니다.
척추를 잡고있는 동안 저속 및 높은 토크의 라멜라와 가시 돌기의 융합에 의해 형성된 V 자형 노치의 중심으로 위쪽으로 뚫습니다. 저항이 눈에 띄게 떨어지면 드릴링을 중단하십시오. 드릴링 위치를 약간 변경하고 50-100 밀리그램의 뼈 가루가 수집 될 때까지 반복하십시오.
추출을 위해 계량 종이에서 2 밀리리터 LoBind 튜브로 뼈 가루를 옮기고 섭씨 20도에서 보관하십시오. 호일을 폐기하기 전에 모든 뼈 조각과 가능한 한 많은 분말이 회수되었는지 확인하십시오. 앞에서 설명한 대로 작업 영역의 오염을 제거하고 샘플 수집을 준비합니다.
작은 계량 용지를 표준 계량 트레이에 넣습니다. 거골 돔을 위쪽으로, 내측 표면을 칭량 트레이 위로 집진기 쪽으로 잡습니다. 저속 및 높은 토크로 설정된 로우 게이지 비트가있는 치과 드릴을 사용하여 거골 목에서 약 1mm 깊이까지 피질 뼈를 긁습니다.
드릴링 위치를 변경하고 약 50-100 밀리그램의 뼈 가루가 수집 될 때까지 이것을 반복하십시오. 이 뼈 분말을 계량 종이에서 추출을 위해 2 밀리리터 LoBind 튜브로 옮깁니다. 분말을 섭씨 20도에서 무기한 보관하십시오.
남은 뼈와 여분의 분말은 섭씨 25도의 건조하고 온도가 조절되는 멸균 환경에 보관하십시오. 모든 폐기물은 오토클레이브 생물학적 위험 백 또는 용기에 폐기하십시오. 재사용 가능한 모든 장비를 멸균하거나 오염을 제거하고 각 샘플링 사이에 UV에 노출시킵니다.
Pars petrosa는 조사 된 다른 23 개의 해부학 적 샘플링 위치보다 더 높은 내인성 DNA를 산출했습니다. 이 프로토콜에 제시된 7 개의 추가 해부학 적 샘플링 위치는 다음으로 높은 수율을 산출했습니다. 대체 위치는 표준 집단 유전학 분석에 적합한 DNA 수율을 일관되게 생성했습니다.
모든 해부학적 샘플링 위치에서 비롯된 라이브러리의 중복률은 낮았으며 이는 높은 복잡성을 나타냅니다. 흉추뿐만 아니라 치아도 적절한 분자 회복을 보였다. 뼈 샘플링의 가장 어려운 측면 중 하나는 드릴을 잡는 방법, 드릴링할 위치, 드릴링을 중지할 시기와 같은 드릴링 프로세스입니다.
