El objetivo general de este procedimiento es monitorear los cambios en las concentraciones de calcio citosólico en las células vivas para diferenciar las respuestas neuronales o glías basadas en cloruro de potasio o estímulos de ATP. El calcio es un segundo mensajero importante involucrado en varios procesos celulares, incluyendo la neurotransmisión, la plasticidad y la apoptosis. El advenimiento de un colorante de calcio fluorescente de alta selección, como Fura-2 AM, asociado con el desarrollo de mejores microscopios fluorescentes y métodos de computación, produjo datos ópticos de alta resolución con un alto grado de resolución espacial y temporal para obtener imágenes de la señalización de calcio en células y organismos vivos.
Este protocolo es adaptable a neuronas enriquecidas, glía purificada o cultivos de población mixta. Rastrea qué tipos de células respondieron a estímulos determinados en función de la respuesta diferencial al cloruro de potasio y ATP. El cloruro de potasio cambia el potencial de membrana de la célula.
Y esto abre canales de calcio dependientes de voltaje, expresados esencialmente por las neuronas. Por otro lado, el ATP activa el canal de gran parte P2X7, presente principalmente en las células gliales. Al acoplar el cloruro de potasio y los estímulos de ATP con otros medicamentos, es posible ver qué compartimento del sistema nervioso está respondiendo a ellos, en función del aumento de la concentración de calcio intracelular.
Para este procedimiento, necesitará algunos instrumentos quirúrgicos o pinzas. Use un gabinete de bioseguridad y realice las mejores prácticas para evitar la contaminación. Para comenzar el cultivo de retina de pollo, abra cuidadosamente un óvulo fertilizado en la parte inferior, donde se encuentra la célula de aire.
Retira el contenido a una placa de Petri y procede a la donación de embriones por decapitación con un par de pinzas. Una vez que se retire la cabeza, llévela a una placa de Petri limpia y agréguele un poco de solución libre de calcio y magnesio. A continuación, retire los ojos, teniendo cuidado de no dañarlos en el proceso.
Lleve el ojo a otra placa de Petri que contenga solución de CMF. Con un par de pinzas, comience a diseccionar el ojo quitando la lente. Luego, comenzando por el orificio dejado por la lente, haga tres o cuatro cortes longitudinales en el ojo.
Retire el cuerpo vítreo transparente con precaución. Asegúrese de que la retina no se una a ella. A continuación, separe suavemente la retina del epitelio pigmentado.
Retire cualquier tejido epitelial restante. Cuando la retina esté totalmente clara, córtela en trozos pequeños. Tome todo el tejido de la retina con la ayuda de una pipeta automatizada.
Centrifuga brevemente la retina para eliminar todo el CMF. Añadir 1 ml de tripsina al 0,25%. E incubar el tejido a 37 C durante 10 minutos.
Detenga la reacción de tripsina agregando 1 ml de medio que contenga 10% de suero fetal de pantorrilla. Centrifuga la retina para eliminar toda la tripsina. Lave las células dos o tres veces con un medio que contenga 10% fcs.
A continuación, agregue 2 ml de medio por retina y disocie suavemente mecánicamente. Diluya las células para que pueda contarlas adecuadamente con un hemocitómetro. Utilice fundas de 15 mm protegidas con poli-L-lisina y laminina para ayudar a la adhesión celular.
Pipete 50 L de sus células diluidas en cada funda. Incubar las células a 37 C en atmósfera de 5% de CO2. Y enfriarlos para fijar el vaso.
Esto debería tomar alrededor de una a dos horas. Añadir 1 ml de medio y devolverlo a la incubadora hasta el día del experimento. Si es necesario, cambie la mitad del medio cada dos o tres días.
Reconstituir un vial de 50 g de Fura-2 AM con 50 L de DMSO. La solución de Krebs es una buena opción para transferir células durante el experimento, ya que no interfiere con la medición de la fluorescencia. Precaliente la solución a 37 antes de comenzar.
Añadir Poloxamer 407. Añadir Fura-2 AM y DMSO. Sonicarlo durante siete minutos en un baño de agua.
Prepare una placa de 6 pocillos agregando la solución Krebs a tres pozos y la solución Fura-2 en otro. Lave el estuche que contiene sus células tres veces antes de agregarlo al pozo Fura-2. Incubar las células a una atmósfera de 37 C y 5% de CO2 durante 30 minutos en una incubadora oscura.
Después de la incubación, lávelo tres veces más. Transfiéralo a otro recipiente que contenga Krebs y protéjalo de la luz. Es posible reutilizar el Fura-2 preparado para incubar más hojas de cubierta con células.
Agregue silicio al soporte y la cámara de la cubierta antes de cada ejecución para evitar fugas de solución. Saque el estuche de la solución krebs y lave cuidadosamente el fondo con agua destilada para evitar la cristalización de sal en la lente del microscopio. Coloque el cubrebocas en el soporte, presionando los bordes con precaución.
Conecte el soporte y la cámara de la cubierta al microscopio y comience a perfundir las células con la solución de Krebs. Seleccione las celdas apropiadas y elija un buen campo. Determinar manualmente las regiones de interés seleccionando cuerpos celulares en función de su morfología distintiva.
Las variaciones de la concentración de calcio se evaluaron cuantificando la relación de la fluorescencia emitida a 510 nm después de la excitación alterna a 340 y 380 nm. Después de agregar cloruro de potasio, es posible ver muchas células brillando y la respuesta de fluorescencia aumentando en el gráfico. El cloruro de potasio abre canales de calcio dependientes de voltaje, que se presentan principalmente en las neuronas.
Cada línea individual en el gráfico representa la región única de interés. Por lo tanto, es posible rastrear las respuestas celulares individuales durante el experimento. Los estímulos atp abren el receptor P2X7, esencialmente expresado por las células gliales.
Este es un cultivo de neuronas enriquecido. Por lo tanto, hay pocas células gliales aquí. Esta es la razón por la que tan pocas células responden a los estímulos atp.
Los valores adquiridos se procesaron utilizando el software Metafluor. Los resultados experimentales se expresan en una tabla de Excel, donde cada fila representa una celda individual y cada línea, un punto de tiempo. Usando el software Excel, es posible trazar las variaciones de calcio de células individuales por separado, o de todas ellas en el mismo gráfico.
Para cuantificar la cantidad de células reactivas a cualquier estímulo, establezca un límite del 30% aumentando los niveles basales de calcio. Aquí utilizamos células de la retina en cultivo de pollitos embrionarios del día 8 para investigar cómo las neuronas y la glía señalan en términos de cambios de calcio, después de recibir estímulos de cloruro de potasio de 50 mm y 1 mm de ATP. En cada experimento, alrededor de 100 células fueron analizadas fácilmente.
La Figura A representa un cultivo mixto que contiene neuronas y glía, que se mantuvo durante una semana. Cuando cuantificamos las respuestas, es posible ver que aproximadamente la mitad de las células analizadas responden cloruro de potasio, y la otra mitad respondió a ATP. La figura B se refiere a un cultivo enriquecido con neuronas.
Se incubó durante solo tres días, por lo tanto, la mayoría de las células gliales aún no se han diferenciado. En este caso, el 89% de las células responden al cloruro de potasio, reforzando la prevalencia de las neuronas. La Figura C muestra un cultivo de glía purificada.
Estas células se mantuvieron durante 10 días con cambios medios cada tres días. Después de ese tiempo, la mayoría de las neuronas mueren, dejando solo la glía. De hecho, esta cultura fue activada únicamente por ATP.
Esta metodología se ha utilizado ampliamente debido a las propiedades universales del calcio como segundo mensajero. El análisis fenotípico se puede mejorar complementando esta metodología con la inmunoquímica de células fijas después de la obtención de imágenes de calcio. Este protocolo también podría adaptarse a otros sistemas de células mixtas que expresan otros canales de calcio.
El consejo importante es encontrar respuestas selectivas de diferentes tipos de células correlacionadas con su expresión fenotípica.
