Este protocolo es significativo porque permite a los investigadores rastrear y cuantificar la distribución de hierro in vivo sin necesidad de radiactividad. Dado que se pueden detectar múltiples isótopos estables de hierro simultáneamente dentro de la misma muestra, esta técnica se puede utilizar para comprender la absorción, regulación y distribución de hierro de diferentes fuentes. Para comenzar, agregue 12 ácido clorhídrico normal al hierro-58 en el vial de vidrio suministrado por el proveedor y reemplace la tapa flojamente.
Para disolver el hierro, caliente la solución a 60 grados centígrados durante una hora. Si aún no se disuelve, deje la solución durante la noche a temperatura ambiente en la campana extractora para que se disuelva. Luego, para generar la solución de cloruro férrico, oxide cualquier cloruro ferroso restante calentando la solución a 60 grados centígrados con la tapa quitada para facilitar la oxidación.
Agregue un microlitro de peróxido de hidrógeno al 35% por cada 50 microlitros de la solución para facilitar aún más la oxidación. Deje la solución de cloruro férrico en la campana a 60 grados centígrados con la tapa quitada para evaporar la muestra. Luego reconstituya el cloruro férrico a 100 milimoles con agua ultrapura.
Calcule la cantidad de agua requerida en función del peso inicial del metal. A continuación, prepare un mililitro de nitrilotriacetato férrico incubando la solución de cloruro férrico preparada con nitrilotriacetato en una proporción de uno a cinco molares en presencia de 20 milimolares de bicarbonato de sodio durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego disuelva 500 miligramos de apotransferrina en cuatro mililitros de tampón de transferencia y carga, y agregue cuatro mililitros de esta solución de apotransferrina a la solución de nitrilotriacetato férrico preparada en el tubo de 15 mililitros.
Para permitir la carga máxima de nitrilotriacetato férrico en apotransferrina, compruebe que la solución está a pH 7,5 y ajuste el pH si es necesario con bicarbonato de sodio o ácido clorhídrico. Incubar la mezcla durante 2 1/2 horas a temperatura ambiente. A continuación, elimine el exceso de nitrilotriacetato férrico no unido y el nitrilotriacetato liberado transfiriendo la solución de transferrina de hierro-58 a una columna de corte de peso molecular y centrifugando la columna.
Después de la centrifugación, lave la columna dos veces agregando 10 mililitros de tampón de carga de transferrina y centrifugando la columna. Luego lave la columna con 10 mililitros de solución salina y centrifugar nuevamente. Finalmente, esterilice la solución de transferrina de hierro-58 usando un filtro de jeringa de 0.22 micrones y guárdela a cuatro grados centígrados hasta que esté lista para usar.
Prepare una solución de transferrina de hierro-58 de 35 miligramos por mililitro en solución salina. Luego coloque una ratona embarazada anestesiada en una almohadilla térmica e inyecte lenta y cuidadosamente la solución de transferrina hierro-58 en el seno retroorbitario. Seis horas después de la inyección, eutanasia al ratón y retire cuidadosamente el útero con fórceps estériles y tijeras de disección.
Cortar una unidad placentaria fetal que comprende un solo feto y placenta en el saco amniótico rodeado por una porción del útero. Luego, corte cuidadosamente a través del útero y el saco amniótico sin alterar al feto y la placenta. Luego retire el saco amniótico y retire el feto y la placenta.
Después de cortar el cordón umbilical, seque el feto y la placenta en una limpieza de tareas para eliminar el exceso de líquido amniótico y registre el peso de toda la placenta. Corta cada placenta por la mitad con una cuchilla de afeitar. Coloque cada mitad en un tubo de dos mililitros y congele rápidamente en nitrógeno líquido.
Para recolectar los hígados del embrión, sacrifique el embrión y fije el embrión para su estabilización dejando el abdomen expuesto. Usando tijeras de disección haga una pequeña incisión donde se unió el cordón umbilical. Inserte un extremo de la tijera de disección en la incisión y realice un corte plano mediano de 1/4 de pulgada hacia el plano coronal.
Luego realice cortes planos transversales para exponer el hígado fetal. Usando fórceps, extirpe el hígado fetal y registre el peso de todo el hígado del embrión. Coloque todo el hígado del embrión en un tubo de dos mililitros y congélelo en nitrógeno líquido.
Almacene los tejidos indefinidamente a menos 80 grados centígrados. Para cuantificar el hierro no hemo en la placenta y los hígados fetales, descongele las mitades placentarias y los hígados fetales completos. Luego pese las mitades placentarias.
Agregue 400 microlitros de solución de precipitación de proteínas a las muestras de tejido y homogeneice el tejido con un homogeneizador eléctrico. Incubar las muestras a 100 grados centígrados durante una hora. Luego enfríelos con agua a temperatura ambiente durante dos minutos.
Abra las tapas para liberar la presión. Luego cierre los tubos nuevamente. Después de centrifugar la muestra para granular los restos de tejido, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo marcado para el análisis ICP-MS.
A continuación, para cuantificar el hierro hemo, registre el peso del pellet obtenido después de la centrifugación. Luego digiera los gránulos en 10 mililitros de ácido nítrico concentrado al 70%, complementado con un mililitro de peróxido de hidrógeno al 30%. Calentar las muestras a 200 grados centígrados durante 15 minutos antes de enviarlas para el análisis ICP-MS.
La medición de ICP-MS permitió la detección de dos isótopos de hierro diferentes. El isótopo de hierro más abundante, hierro-56, refleja cambios crónicos de iones en los tejidos. Otro isótopo, el hierro-58, refleja cambios agudos en la distribución del hierro inyectado.
La medición de hierro-56 confirmó que los hígados embrionarios de embarazos deficientes en hierro habían disminuido las reservas de hierro en comparación con los de los embarazos repletos de hierro. La medición de hierro-58 confirmó que en embarazos con deficiencia de hierro, se transfirió menos hierro al hígado embrionario durante seis horas que en embarazos repletos de hierro. Mientras realiza el procedimiento, recuerde registrar el peso de los tejidos.
Estos pesos son necesarios para calcular las concentraciones de hierro. Dado que el hierro-58 no requiere precauciones especiales de manipulación y eliminación, el tejido no procesado se puede utilizar para otros análisis, incluyendo, pero no limitado a Western blot, o qPCR.
