Этот протокол важен, потому что он позволяет исследователям отслеживать и количественно оценивать распределение железа in vivo без необходимости радиоактивности. Поскольку несколько стабильных изотопов железа могут быть обнаружены одновременно в одном образце, этот метод может быть использован для понимания поглощения, регулирования и распределения железа из разных источников. Для начала добавьте 12 обычных соляных кислот к железу-58 в стеклянном флаконе, поставляемом продавцом, и свободно замените колпачок.
Чтобы растворить железо, прогрейте раствор при 60 градусах Цельсия в течение одного часа. Если раствор еще не растворен, оставьте раствор на ночь при комнатной температуре в вытяжке для растворения. Затем, чтобы получить раствор хлорида железа, окисляют любой оставшийся хлорид железа, нагревая раствор до 60 градусов Цельсия со снятой крышкой для облегчения окисления.
Добавьте один микролитр 35% перекиси водорода на 50 микролитров раствора для дальнейшего облегчения окисления. Оставьте раствор хлорида железа в вытяжке при температуре 60 градусов Цельсия, сняв крышку, чтобы испарить образец. Затем восстановите хлорид железа до 100 миллимолей сверхчистой водой.
Рассчитайте необходимое количество воды, исходя из исходного веса металла. Далее готовят один миллилитр нитрилотриацетата железа путем инкубации приготовленного раствора хлорида железа с нитрилотриацетатом в молярном соотношении один к пяти в присутствии 20-миллимолярного бикарбоната натрия в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем растворяют 500 миллиграммов апотрансферрина в четырех миллилитрах переносного и нагрузочного буфера и добавляют четыре миллилитра этого раствора апотрансферрина к приготовленному раствору нитрилотриацетата железа в 15-миллилитровой пробирке.
Чтобы обеспечить максимальную нагрузку нитрилотриацетата железа на апотрансферрин, проверьте, что раствор находится при рН 7,5 и при необходимости отрегулируйте рН бикарбонатом натрия или соляной кислотой. Инкубировать смесь в течение 2 1/2 часов при комнатной температуре. Далее удаляют избыток несвязанного нитрилотриацетата железа и высвобождают нитрилотриацетат путем переноса раствора трансферрина железа-58 в отсечную колонну молекулярной массы и центрифугирование колонны.
После центрифугирования промыть колонну дважды, добавив 10 миллилитров буфера нагрузки трансферрина и центрифугируя колонну. Затем снова промыть колонну 10 миллилитрами физиологического раствора и снова центрифугировать. Наконец, стерилизуйте раствор железа-58 трансферрина с помощью 0,22-микронного шприцевого фильтра и храните при четырех градусах Цельсия до готовности к использованию.
Готовят 35 миллиграмм на миллилитр раствора железа-58 трансферрина в физиологическом растворе. Затем поместите обезболенную беременную мышь на грелку и медленно и осторожно вводят раствор трансферрина железа-58 в ретроорбитальный синус. Через шесть часов после инъекции усыпьте мышь и осторожно удалите матку с помощью стерильных щипцов и ножниц для рассечения.
Отрежьте плацентарную единицу плода, состоящую из одного плода и плаценты в амниотическом мешке, окруженном частью матки. Далее аккуратно прорежьте матку и околоплодный мешок, не нарушая плод и плаценту. Затем очистите околоплодный мешок и удалите плод и плаценту.
После перерезания пуповины промокните плод и плаценту на чистом задании салфеткой, чтобы удалить лишнюю амниотическую жидкость, и зафиксируйте вес всей плаценты. Разрежьте каждую плаценту пополам лезвием бритвы. Поместите каждую половину в двухмиллилитровую трубку и заморозьте в жидком азоте.
Чтобы собрать печень эмбриона, принесите в жертву эмбрион и зафиксируйте эмбрион для стабилизации, оставив брюшную полость открытой. С помощью ножниц для рассечения делают небольшой разрез, где была прикреплена пуповина. Вставьте один конец ножниц для рассечения в разрез и выполните 1/4-дюймовую среднюю плоскость, разрезанную к корональной плоскости.
Затем выполните поперечные плоские разрезы, чтобы обнажить печень плода. С помощью щипцов удаляют печень плода, и записывают вес всей печени эмбриона. Поместите всю печень эмбриона в двухмиллилитровую трубку и заморозьте ее в жидком азоте.
Храните ткани неопределенно долго при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы количественно оценить негемовое железо в плацентах и печени плода, разморозьте половинки плаценты и целую печень плода. Затем взвесьте плацентарные половинки.
Добавьте 400 микролитров раствора осаждения белка к образцам тканей и гомогенизируйте ткань с помощью электрического гомогенизатора. Инкубируйте образцы при температуре 100 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем охладите их при комнатной температуре водой в течение двух минут.
Откройте колпачки, чтобы снять давление. Затем снова закройте трубки. После центрифугирования образца для гранулирования тканевого мусора осторожно перенесите супернатант в новую маркированную пробирку для анализа ICP-MS.
Далее, чтобы количественно оценить гемовое железо, запишите вес окатыша, полученного после центрифугирования. Затем переварить гранулы в 10 миллилитрах концентрированной 70%-ной азотной кислоты, дополненной одним миллилитом 30%-ной перекиси водорода. Нагревайте образцы до 200 градусов Цельсия в течение 15 минут, прежде чем отправить их на анализ ICP-MS.
Измерение ICP-MS позволило обнаружить два различных изотопа железа. Наиболее распространенный изотоп железа, железо-56, отражает хронические изменения ионов в тканях. Другой изотоп, железо-58, отражает острые изменения в распределении вводимого железа.
Измерение iron-56 подтвердило, что печень эмбрионов от беременностей с дефицитом железа уменьшила запасы железа по сравнению с таковыми при беременностях, полных железа. Измерение iron-58 подтвердило, что при беременностях с дефицитом железа меньше железа переносилось в печень эмбриона в течение шести часов, чем при беременностях, полных железа. Выполняя процедуру, не забудьте записать вес тканей.
Эти веса необходимы для расчета концентрации железа. Поскольку железо-58 не требует особых мер предосторожности при обращении и утилизации, необработанная ткань может быть использована для других анализов, включая, но не ограничиваясь, вестерн-блоттингом или qPCR.
