Una aplicación exitosa de estas técnicas permitirá la evaluación cinética de ensayos farmacológicos o el paso de contaminantes xenobióticos a través de una placenta morfológicamente intacta. La técnica de perfusión de placenta de roedores permite un mayor rendimiento de estudios farmacológicos o toxicológicos, ya que se pueden evaluar múltiples compuestos utilizando el tejido de una sola presa. Demostrando la técnica estará Jeanine D'Errico, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.
Antes de comenzar el procedimiento, llene suavemente todas las cámaras, agujas, micropipetas de vidrio, tubos y depósitos con solución de sal fisiológica calentada o PSS, eliminando cuidadosamente cualquier burbuja de aire con una pipeta de transferencia con punta fina según sea necesario. Gire todos los llaveros de tres vías a la posición de apagado para asegurar el líquido dentro de las pipetas. Coloque una sola corbata en cada una de las dos micropipetas de vidrio preparadas para la cannulación uterina y en las dos agujas de punta contundente designadas para la canulación umbilical.
A continuación, fije los lazos para evitar la pérdida durante los movimientos de la cámara. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un día gestacional anestesiado 20 hembra rata embarazada, levante un cuerno uterino del abdomen y extienda el cuerno hacia afuera largos, externo al animal. Use suturas de seda trenzadas para atar la arteria uterina en los extremos vaginal y ovárico del cuerno, incluyendo el ovario dentro de la sutura con el cuerno uterino.
Usando tijeras quirúrgicas, haga incisiones en el lado proximal de la corbata del ovario y el lado distal de la corbata vaginal. Transfiera el cuerno uterino a un plato disección forrado con goma de silicona y lleno de PSS frío. Con el lado del ovario a la izquierda y el lado vaginal hacia la derecha, empuje suavemente un pasador diseccionador a través del cuerno uterino en el caucho de silicona para estabilizar el útero.
Seleccione una unidad fetal de placenta materna central en el cuerno. Usando fórceps finos y tijeras, retire la membrana amniótica de la superficie fetal de la placenta teniendo cuidado para evitar el cordón umbilical. Desentrañar y ligar el cordón umbilical para separar al cachorro fetal.
Después de identificar la arteria umbilical y la vena, separe suavemente y liga los vasos umbilicales. Luego corta la vena umbilical ligeramente más corta que la arteria umbilical para facilitar la identificación. Y ligar la arteria uterina y la vena con tijeras quirúrgicas.
Manteniendo la orientación correcta del flujo sanguíneo anatómico de la arteria uterina, coloque la unidad placentaria en la cámara de vaso aislado modificada llena de PSS oxigenado en caliente bajo un microscopio diseccionante. Usando un par de fórceps finos en cada mano, canular los extremos proximal y distal de la arteria uterina sobre las micropipetas de vidrio. Asegure firmemente la arteria con la sutura de nylon estéril previamente colocada.
Cannula y fija la arteria umbilical en la aguja contundente del calibre 23. A continuación, puedenular y asegurar la vena umbilical en la aguja contundente del calibre 25 y rellenar todos los llaveros y tubos para evitar burbujas de aire. Recuerde revisar todos los tapones, cánulas y tubos en busca de burbujas de aire, ya que un bolo de aire en el sistema conducirá a la angustia celular y eliminará el flujo de corriente del contador dentro de la placenta.
Conecte todos los tubos según la figura. Coloque pequeños botes de pesaje bajo la canulación distal de la arteria uterina materna y debajo de la canulación de la aguja de la vena umbilical fetal para atrapar el efluente que surgirá durante el curso del procedimiento. Prepare la placa de recogida para el efluente para su posterior análisis.
Abra la llave para permitir el flujo de fluidos a través del tubo hacia la placenta y encienda la bomba peristáltica, el control de presión y el monitor de presión. Aumente lentamente la presión a 80 milímetros de mercurio leído en el monitor de presión. Abra lentamente el llave para permitir el flujo de fluidos a la arteria uterina.
Rellene todos los depósitos para mantener el volumen de líquido durante todo el experimento. Después de que los tejidos se hayan equilibrado durante 30 minutos para permitir que la vasculatura se ajuste al nuevo flujo de fluido, establezca la perfusión basal mediante la recolección de efluentes durante 10 minutos de ambos barcos de pesaje. Mida el volumen de líquido que emerge a través de la arteria uterina y la vena umbilical.
Al final del período de recolección basal, administre el tratamiento experimental en la arteria uterina. Luego recoja muestras de la arteria uterina distal y del efluente de la vena umbilical fetal cada 10 minutos durante un total de 180 minutos después de la perfusión. Mida los contaminantes dentro de las muestras de fluidos.
La perfusión con tinte azul Evans para probar el sistema y visualizar la función adecuada de barrera fluida y placentaria para prevenir la transferencia de contaminantes al compartimento fetal revela que el tinte alcanzó y perfundió el tejido placentario dentro de este sistema. Tras una investigación más estrecha, está claro que el tinte azul Evans no entró en la vena umbilical fetal, lo que se espera, ya que el tinte azul Evans está destinado a la albúmina. En este experimento representativo, se identificó una transferencia de fluido reducida al compartimento fetal dentro de los 10 minutos posteriores a la perfusión de poliestireno.
La transferencia de poliestireno al compartimento fetal alcanzó su punto máximo a los 20 minutos y continuó durante 90 minutos. Lo más importante a recordar durante la cánula es ir lentamente. Las pipetas y el tejido son muy delicados y pueden romperse o romperse fácilmente.
Al sopesar la efluencia, esta metodología podría utilizarse para investigar la fisiología placentaria, así como la translocación material.
