La separación de vesículas extracelulares de fluidos como los medios de cultivo celular de condición puede permitir a los investigadores caracterizar la carga vesticular y explorar sus mecanismos de comunicación intracelular. Esta técnica permite una separación suficiente de EV y proteínas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados que es sencilla y fácil de usar. Para comenzar, coloque PBS en un baño de agua de 37 grados centígrados.
Observar los matraces de cultivo celular de control y tratados con tunicamicina bajo un microscopio compuesto con una lente objetivo de 10 x y 100 x. Tome nota de cualquier diferencia entre los frascos. Retirar el medio del matraz y colocarlo en un tubo de 50 mililitros.
Luego centrifugar el tubo a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y transferir el súper nadante a un nuevo tubo. Centrifugar el tubo a 2000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el súper nadante a un tubo nuevo y colóquelo en hielo.
Tome cuatro unidades de ultrafiltración de corte de 15 mililitros y tres kilodaltons y agregue cinco mililitros de PBS a cada tubo. Prepare los filtros centrifugando las unidades a 4, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de eliminar el PBS de las unidades, divida el sobrenadante de las condiciones de control y tratadas en dos unidades de ultrafiltración, cada una con aproximadamente 12.5 mililitros de medios en cada una.
Centrifugar los tubos a 4, 000 G durante una hora y 45 minutos a cuatro grados centígrados o hasta que el medio concentrado o retentado en cada unidad se concentre a 250 microlitros o menos. Transfiera el retención de ambas unidades de control a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetado y de las unidades tratadas a otro tubo. Mida el volumen total del retenente en cada tubo de microcentrífuga.
Si el volumen es inferior a 500 microlitros, agregue 0,22 micras de PBS filtrado hasta que el volumen final sea de 500 microlitros. Coloque los tubos en un congelador de menos 80 grados centígrados. Encienda el colector automático de fracciones o AFC.
Retire la columna de cuatro grados centígrados y permita que la columna se caliente a temperatura ambiente. Retire las muestras retenidas del congelador de menos 80 grados centígrados y colóquelas en hielo para descongelar, mientras espera, coloque ocho tubos etiquetados de 1.5 mililitros en el carrusel AFC con tapas hacia adentro. Inserte la columna en el AFC con el código de barras frente al lector y ajuste la configuración para recolectar ocho fracciones de 500 microlitros cada una y almacenar el volumen de búfer por defecto.
A continuación, compruebe las instrucciones en pantalla para iniciar la recopilación. Después de que el búfer de almacenamiento se absorbe completamente en la parte superior de la matriz de columna. Comience a enjuagar la columna agregando 15 mililitros de PBS a la columna.
No agregue PBS demasiado pronto, ya que diluirá el tampón de almacenamiento y evitará el lavado adecuado. Justo antes de que los 15 mililitros de PBS sean absorbidos por la matriz, haga clic en OK para detener el lavado y eliminar cualquier PBS residual de la parte superior de la matriz de la columna con una micropipeta. No toque la matriz.
Agregue 500 microlitros de muestra al centro de la columna y haga clic en Aceptar para comenzar la ejecución. Después de que la muestra se absorba completamente en la matriz, agregue inmediatamente ocho mililitros de PBS a la columna. AFC disipa automáticamente el volumen vacío en el centro del carrusel antes de recolectar las ocho fracciones de 500 microlitros cada una.
Después de la carrera, retire las fracciones del carrusel y colóquelas en hielo. A continuación, retire el volumen vacío del centro del carrusel. A continuación, agregue 10 mililitros de PBS a la columna para lavar cualquier muestra residual de la columna.
Y una vez que la muestra arrepentida se haya enjuagado por completo, agregue 15 mililitros de PBS a la columna. A medida que el PBS final está siendo absorbido por la matriz, agregue 500 microlitros de hidróxido de sodio molar 0.5 al centro de la matriz de la columna. Luego, a medida que se absorbe el hidróxido de sodio, agregue 30 mililitros de PBS a la columna y déjelo enjuagar.
Una vez hecho con todas las muestras, conserve la columna para su uso posterior agregando 15 mililitros de azida de sodio al 0,05% a la columna. Deje aproximadamente cinco mililitros de azida de sodio en la parte superior de la matriz de la columna. Retire la columna del AFC y coloque las tapas superior e inferior antes de colocar la columna a cuatro grados centígrados para su almacenamiento.
Construir la unidad de ultra filtración. Obtenga dos mililitros, tres unidades de ultrafiltración de corte kilodalton por muestra. Cada unidad se compone de tres partes, cono, filtro y flujo a través del cilindro.
Etiquete cada parte correctamente. Agregue un mililitro de PBS a la porción del filtro y cubra con la pieza del cono. Centrifugar el lado del cono de la unidad de ultrafiltración hacia arriba a 3, 500 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y retirar el PBS filtrado del cilindro de flujo a través.
Voltee la unidad de ultrafiltración boca abajo y centrifugar durante dos minutos a 1000 G a cuatro grados centígrados para eliminar cualquier PBS restante. Combine cuatro 500 microlitros de cada fracción y agréguelos a la unidad de ultrafiltración. Luego, las columnas de centrífuga coinciden durante una hora, 45 minutos a 3, 500 G a cuatro grados centígrados o hasta que el nivel de retentación es de 100 microlitros.
Retire el flujo a través del cilindro y deseche el flujo a través. Voltee la unidad de ultrafiltración boca abajo y centrifugar durante dos minutos a 1000 XG a cuatro grados centígrados. Transfiera el retentado en el cono a un tubo de 1.5 mililitros y haga el volumen de muestra a 150 microlitros con PBS filtrado de 0.22 micrones antes de colocar los tubos en un congelador de menos 80 grados centígrados.
Un bloque occidental representativo de fracciones individuales mostró una fuerte expresión de CD9, CD63 y CD81. Infracciones de uno a cuatro con poca o ninguna expresión infracciones de cinco a ocho. No se observó expresión de GM130 o calnexina en ninguna fracción.
La albúmina sólo estaba presente en las fracciones seis a ocho. También se evaluó la efectividad de concentrar las fracciones EV y proteica. Se observó expresión de CD9 y CD63 en los lisados celulares.
Las tres proteínas CD estaban presentes en las fracciones EV de las muestras tratadas con tunicamicina y control, pero no en las fracciones de proteínas. El gen de susceptibilidad tumoral 101 estaba presente en los lisados celulares, pero no en las fracciones EV o proteicas. El GM130 y la calnexina sólo se observaron en los lisados celulares.
En el western blot de los medios de cultivo celular agotados con exosomas, los marcadores EV estaban presentes en los lisados celulares, pero no en las muestras de medios. Se observó expresión de albúmina en las fracciones proteicas y mínima expresión en los lisados celulares. Las observaciones de TEM demostraron estructuras esféricas en las fracciones EV de las muestras de control y tratadas con tunicamicina.
Estas estructuras no se observaron en ninguna de las fracciones proteicas del tipo muestral. El análisis de seguimiento de nanopartículas revela diferencias en las concentraciones de partículas de control y fracciones tratadas en fracciones EV en comparación con el control, ligeramente más partículas estaban presentes en el tratamiento con tunicamicina. Sin embargo, en las fracciones de proteínas, se detectaron menos partículas en relación con los EV.
Es importante tener el mismo volumen de muestra para las condiciones de control y tratadas, lo que permite una fácil comparación de los EV de los diferentes tratamientos. Después de separar los EVs de los medios de cultivo celular de la condición, podemos caracterizar el contenido de proteínas, ARN y lípidos de las vesículas con secuenciación de ARN proteómica y lipidómica.
