Este protocolo es significativo ya que no solo demuestra enfoques para purificar vesículas de cultivo a diferentes escalas, compensaciones, diferencias entre metodologías y también consideración para trabajar con muestras de campo. Las cianobacterias presentan desafíos únicos de muestreo y análisis de vesículas. Estas técnicas han aislado y concentrado con éxito vesículas de cultivo y de muestras ambientales.
Para concentrar muestras de menos de 500 mililitros, comience por enjuagar los concentradores centrífugos de ultrafiltración de 15 a 20 mililitros con agua de grado ultrapuro Tipo 1. Cargue los concentradores en la centrífuga y gire a 4, 400 x g a cuatro grados centígrados. Descarta la ejecución y repite el paso al menos dos veces.
Cargue la muestra de sobrenadante en un concentrador enjuagado con agua y gire en las mismas condiciones. Repita este paso hasta que la muestra se concentre en un volumen final de 15 a 30 mililitros. Para concentrar un volumen de más de 500 mililitros, realice una filtración de flujo tangencial configurando el aparato como se describe en el manuscrito.
Conecte una bomba peristáltica a la línea de admisión y coloque abrazaderas ajustables en la línea de retención. Desinfecte la filtración de flujo tangencial como se describe en el manuscrito, luego enjuague el dispositivo con un litro de agua de grado ultrapuro Tipo 1. Añadir menos de 0,2 micras de filtrado en el depósito de muestras.
Aumente lentamente la velocidad de la bomba y los niveles de contrapresión en la línea de retención para aumentar la salida de las líneas de filtrado. Continúe ejecutando la filtración de flujo tangencial y rellene el reservorio con sobrenadante de cultivo a medida que se retira el material. Deje de concentrar la muestra una vez que el volumen en el depósito alcance la cantidad más baja posible necesaria para mantener el flujo en la línea de admisión sin introducir burbujas de aire.
Cierre la línea de salida con una abrazadera. Retire la contrapresión en la línea de retención. Recircule el sobrenadante concentrado a través del filtro durante 10 minutos, reduciendo la tasa de recirculación de 20 a 40 mililitros por minuto para maximizar la recuperación.
Mueva la línea de retención a un recipiente limpio, retire la línea de admisión de la muestra y recoja el material concentrado. Recupere cualquier material restante en el depósito de muestras utilizando una pipeta. Filtre el sobrenadante concentrado a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras.
Si es necesario, guarde el concentrado final a cuatro grados centígrados durante aproximadamente tres semanas antes de pasar a la purificación de vesículas. Para granular la muestra de cultivo concentrado, colóquela en un tubo de ultracentrífuga limpio y agregue medios limpios o tampón para asegurarse de que el tubo esté lleno. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante con una pipeta.
Vuelva a lavar el material peletizado con medios de cultivo frescos o tampón de lavado, como solución salina tamponada con fosfato 1X y repita la centrifugación. Vuelva a suspender el pellet final en cultivo fresco mediante pipeteo suave con una pipeta de un mililitro y transfiéralo a un recipiente limpio. Para realizar la ultracentrifugación del gradiente de densidad, prepare las existencias de iodixanol como se describe en el manuscrito.
Mezcle una parte del tampón 4X con tres partes de stock de iodixanol al 60% para hacer una solución de iodixanol al 45%. Diluya 45% de iodixanol con tampón 1X para crear existencias de medios degradados de 40, 35, 30, 25, 20, 15 y 10% concentraciones finales de iodixanol. Luego, superponga cuidadosamente cantidades iguales de todas estas existencias de gradiente de iodixanol en un tubo de ultracentrífuga, utilizando todo el volumen del tubo.
Después de la centrifugación, recoja las fracciones de 0,5 mililitros cada una para aproximadamente un gradiente de 4,5 mililitros mediante el pipeteo cuidadoso o el uso de un colector de fracciones. Determine la densidad de cada fracción, en gramos por mililitro, utilizando una balanza analítica y una pipeta calibrada. Retire la muestra del tubo, determine el peso y devuelva la muestra al tubo.
Diluya las fracciones individuales con tampón limpio en un tubo nuevo seguido de un medio limpio o lavado tampón. Aplique con cuidado cinco microlitros de vesícula y déjelo reposar durante cinco minutos. Retire la muestra tocando el borde de una rejilla con un trozo de papel de filtro limpio.
Pipetear de 20 a 50 microlitros de acetato de uranilo al 2% sobre una superficie plana cubierta por una película de plástico. Luego coloque la rejilla flotando sobre ella durante dos minutos. Retire el acetato de uranilo con papel de filtro y flote brevemente sobre una gota de agua ultrapura para lavar.
Llene la cámara con agua ultrapura con una jeringa limpia y asegúrese de que no haya burbujas de aire. Haga clic en iniciar cámara y visualice la región óptima de la cámara alrededor de la huella digital. Deslice los controles deslizantes de ganancia de pantalla y nivel de cámara hacia el máximo, luego disminuya al nivel más bajo para ver las partículas más tenues.
Ajuste el enfoque según sea necesario para asegurarse de que las partículas sean aproximadamente igualmente visibles en todo el campo de visión y continúe lavando con agua ultra limpia hasta que la cámara esté limpia. Agregue la muestra de vesícula a la cámara con una jeringa de un mililitro y confirme la configuración de adquisición. Seleccione la medición estándar en el cuadro desplegable SOP y cambie la configuración para recopilar al menos tres réplicas técnicas de videos de 60 segundos cada una.
Presione create'and run script' y siga las indicaciones y empuje aproximadamente 100 microlitros de muestra en la cámara entre réplicas. Determine los parámetros de partícula haciendo clic en análisis 'y abrir experimento' y cargue el archivo de muestra. Seleccione procesar archivos seleccionados y espere a que se complete el análisis.
El aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares de la cianobacteria Synechocystis sp. PCC6803, mostró que la membrana externa contiene carotinoides, que confieren una coloración anaranjada característica a las muestras de vesículas recogidas por peletización directa mediante ultracentrifugación. El pellet de vesícula resuspendido se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión, ya sea teñiendo negativamente las muestras con acetato de uranilo o observando secciones ultrafinas.
La distribución y concentración del tamaño de las vesículas se evaluaron mediante análisis dinámicos de dispersión de luz y seguimiento de nanopartículas. Las vesículas purificadas de Synechocystis sp. PCC6803 se separaron en un gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida y se tiñeron para lipopolisacáridos.
Las muestras deben tomarse antes y después de la muestra de vesícula concentrada para asegurarse de que la filtración de flujo tangencial está funcionando y las vesículas se están concentrando. Luego debe medir ambas muestras utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas. Se requieren esfuerzos futuros para fusionar este método con otros enfoques, como la cromatografía de exclusión de tamaño o el fraccionamiento asimétrico de flujo de campo para mejorar la discriminación y el aislamiento de partículas pequeñas de cultivo y muestras ambientales.
Esta técnica es útil para estudiar las vesículas de cianobacterias y los roles funcionales específicos de estas vesículas en la biología de las cianobacterias.
