Las Vesículas Extracelulares se utilizan cada vez más como un biomarcador de diagnóstico y herramienta terapéutica potencial en muchos campos. Flow Cytometric es el método analítico más directo para caracterizar por marcadores enfrentados a trajes que este protocolo se puede utilizar en el análisis de una partícula asalizada, es rápido y es aplicable a los sismómetros convencionales sin necesidad de un ajuste especial o el instrumento dedicado. Aunque este protocolo se utiliza para clasificar las Vesículas Extracelulares de dicha condición y medio, se puede ampliar hacia la categorización de los AV de la sangre, para reemplazar las biopsias de tejido invasiva en los pacientes.
Para los investigadores nuevos en el protocolo, es fundamental realizar los pasos descritos en la sección del método de configuración, y seguir de cerca las estrategias de obtención demostradas Comenzar por el recubrimiento de 55 centímetros cuadrados Petri-platos con 02%gelatina de piel porcina, en PBS. Después de 15 minutos, lave el plato y la placa 4,4 veces 10 a las quintas células progenitoras cardíacas en cada plato en 7 mililitros del Medio de Dulbecco Modificado de Iscove, o IMDM, complementado con 20%suero bovino fetal, y 1%penicilina y estreptomicina para su incubación a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Cuando las células alcanzan aproximadamente el 80%confluencia, lave los cultivos dos veces con PBS de Dulbecco sin calcio y magnesio y alimente las células con 10 milileters de medio de producción de exosomas libres de suero.
Después de 7 días, acope el medio acondicionado de cada placa, en un solo tubo centrífugo de polipropileno y centrifugar el medio para eliminar cualquier residero celular. Transfiera el sobrenentamiento a un tubo de filtro centrífuga de 100 kilodalton, y concentre el medio despejado, acondicionado, con una centrifugación adicional. Transfiera el concentrado a un tubo de micro centrífuga para una centrifugación de sobremesa final y añada el sobrenadante en un tubo de micro centrífuga de pared gruesa de policarbonato.
Llene el tubo con PBS, a un volumen final de 3,2 milileters, y cargue la muestra en un rotor de ángel fijo de titanio. A continuación, cargue el rotor en una ultracentrífuga de mesa para una ultracentrifugación, y resuspender el pellet en 100 microlitros de PBS fresco. Para el seguimiento de nanopartículas y la cuantificación del análisis, diluir 1 microlitro de la muestra ultracentrifugada, en 999 microlitros de PBS, y cargar la muestra en una jeringa de 1 milileter sin burbujas.
Cargue la jeringa en el puerto de entrada de la cámara de examen y encienda el láser. Utilice el botón de captura para abrir la cámara y ajustar el enfoque. A continuación, registre al menos tres fotogramas diferentes de 60 segundos cada uno, y utilice la opción de proceso por lotes en el software, para analizar las tres adquisiciones diferentes.
Para preparar la muestra para la adquisición, primero agregue las cuentas de captura conjugadas de anticuerpos monoclonales experimentales apropiadas en una proporción de 1:1:1, en un tubo de micro centrífuga, y vórtice la piscina de cuentas de captura resultante. A continuación, agregue el volumen adecuado de muestra a 1 microlitro de la piscina de cuentas de captura para generar un 1 por 10 a las 8 partículas más 1,2 veces 10 a las 5a perlas por concentración de prueba. Agregue 1 microlitro de perlas a un tubo etiquetado con cuentas como control negativo, y ajuste el volumen en cada tubo a 100 microlitros con PBS fresco.
A continuación, coloque los tubos en un mezclador térmico, con agitación, a 400 rotaciones por minuto, y de 4 a 10 grados centígrados, durante la noche. Al día siguiente, transfiera las muestras a una placa redonda inferior de 96 pozos, y agregue los anticuerpos conjugados de florescencia apropiados a cada pozo. Después de una incubación de 1 hora a 4 a 10 grados Celsius, agregue 100 microlitros de PBS a cada pozo, y abra el software de adquisición.
Seleccione el citómetro y el programa de arranque del sistema, para iniciar el instrumento y abrir un nuevo experimento. Cree una plantilla experimental y seleccione la placa y agregue la placa. Seleccione la posición de las muestras en la placa y haga clic en establecer como muestra.
Introduzca el nombre de la muestra en las reglas de nomenclatura, abra la pestaña de canal y seleccione los canales de señal de florescencia adecuados. Ahora cargue la placa en el instrumento. Y haga clic en gráfica de puntos, para crear un nuevo área de dispersión hacia delante frente a la gráfica de puntos de área de dispersión lateral.
Seleccione inicializar para iniciar el láser y los fluidos y haga clic en Ejecutar para iniciar la adquisición. Ajuste la escala para mostrar la población en el medio de la gráfica de dispersión hacia delante frente frente a lado, y dibuje una puerta de cuentas alrededor de toda la población de la muestra para excluir los desechos. Haga clic en stop and dot plot para crear una altura de dispersión hacia delante frente en un gráfico de puntos de dispersión hacia delante y atrapese la muestra en la población de cuentas.
Dibuje una nueva puerta alrededor de la población más grande y asígnela Singlets, y haga clic en gráfica de puntos para crear una gráfica de puntos de dispersión de lado frente a la gráfica de puntos de dispersión lateral, por fluoróforo experimental utilizado. Cierra la nueva gráfica de puntos en los Singlets. A continuación, seleccione el número de eventos que desea grabar y seleccione registro para iniciar la adquisición experimental.
Al final del análisis, cargue los archivos de adquisición en el software de análisis adecuado y abra un nuevo protocolo. Cree trazados de puntos para cada archivo como se acaba de demostrar y establezca todo el eje de dispersión en escala lineal y todo el eje florescente en la escala de registro. A continuación, muestre la media geométrica de florescencia en los canales de señales relevantes, para calcular el cambio completo en la intensidad media de la florescencia, en las diferentes preparaciones de vesícula extracelular.
Después de probar diferentes condiciones para establecer la menor cantidad total de vesículas extracelulares para alcanzar la fase exponencial temprana de una curva de intensidad de florescencia media, se determinó que el número mínimo de partículas era de 1 por 10 a 8 partículas por tinción. Se determinó que la concentración óptima de anticuerpos durante 1 veces 10 a las 8 partículas para lograr la señal más alta sin unión de anticuerpos inespecíficos era de 10 microgramos por mililitro para anticuerpos anti CD9_FITC y anti CD63_PE y cinco microgramos por mililitro para el anticuerpo anti CD81_PE. Para confirmar la idoneidad del método, para analizar las vesículas extracelulares en forma de copa, y no los residuos de membrana, las vesículas extracelulares fueron sonicadas, lo que resultó en una disminución en la intensidad media de la florescencia, después de tan solo 30 segundos de sonicación, sin que se detectaran florescencias en absoluto después de un minuto de interrupción mecánica.
La purificación propia de X a partir de células progenitoras cardíacas como se ha demostrado, produce vesículas extracelulares, expresando bajos niveles de CD9 y altos niveles de CD63 y CD81 de ambas poblaciones celulares. Además, mientras que los marcadores de superficie propios de X son claramente identificables sin ultracentrifugación, este paso de enriquecimiento mejora en gran medida la intensidad media de la florescencia de estos marcadores. Cuando se trabaja con vesículas extracelulares, hay más pellets de nanopartículas descuidados que se pueden perder fácilmente.
Por lo tanto, es esencial seguir todos los pasos como se muestra en el protocolo. El uso de vesículas extracelulares como biomarcador es ahora una de las investigaciones de campo más emergentes. Y pronto, puede traducirse en el diagnóstico clínico utilizado como una herramienta alternativa de cribado.
