Los exosomas pueden reaccionar a las vesículas secretadas por una célula de entre 14 y 200 nanómetros de tamaño, y separarse de la carga intracelular y la comunicación, que llega al subgrupo más pequeño de vesículas extracelulares. Los exosomas que se forman como resultado de la diferenciación del endosoma, se originan en la membrana celular. Las células madre se pueden aislar de diferentes fuentes como la médula ósea o los tejidos adiposos.
pero las células madre secas de tejido adulto tienen un mayor potencial inmunogénico Contras del tamaño de los exosomas, se dice que ha desempeñado un papel importante en la enfermedad del sistema nervioso central porque puede pasar a través de la barrera hematoencefálica. Para comenzar, lave las células madre mesenquimales de gelatina de Wharton con semillas con cinco mililitros de PBS. A continuación, añada cinco mililitros de solución de tripsina EDTA antes de colocar el matraz en una incubadora.
Después de la incubación, recoja las células y centrifugue a 1.500 G durante cinco minutos. A continuación, retire el sobrenadante y añada al tubo un mililitro de DMEM-F12 que contenga un 10% de FBS. Lave las células cultivadas con PBS.
Después del lavado, agregue medio DMEM-F12 libre de suero a las células y colóquelo en la incubadora. Para aislar los exosomas, recoja el medio libre de suero y centrifugue a 300 G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y procéselo por centrifugación en serie a velocidades más altas.
Después de la centrifugación final, retire lentamente el sobrenadante y disuelva el gránulo en un mililitro de PBS. Mezclar por vórtice y proceder a la ultracentrifugación a 110.000 G durante 70 minutos a cuatro grados centígrados. Añadir tres mililitros de PBS a la suspensión de exosomas recogida previamente por ultracentrifugación y esterilizar la suspensión diluida por filtración utilizando un filtro de 0,22 micras.
A continuación, transfiera 500 microlitros de la suspensión de exosomas esterilizada a otro tubo. A continuación, de forma secuencial, agregue 500 microlitros de 0,5 miligramos por mililitro de solución de dopamina y saponina en la suspensión esterilizada. Después de la incubación, ultracentrifugar la suspensión.
La muestra puede utilizarse para el análisis de NTA y DLS para caracterizar los exosomas cargados de dopamina o almacenarse a menos 20 grados centígrados hasta su uso posterior. En el análisis de NTA, se determinó que el tamaño medio de los exosomas derivados de la gelatina de Wharton era de 98 nanómetros y el de los exosomas cargados de dopamina de 110 nanómetros. El número de nanopartículas reveladas por los análisis de NTA y DLS fue consistente entre sí.
El potencial zeta de los exosomas derivados de la gelatina de Wharton se midió en menos 15,7 y los exosomas cargados de dopamina en menos 17,6 milivoltios. El análisis por HPLC de los exosomas cargados de dopamina detectó el pico de dopamina a los 6,45 minutos. El perfil acumulativo de liberación del fármaco reveló que el 74,8% de la dopamina encapsulada se liberó de los exosomas en las primeras ocho horas.
Se investigó la citotoxicidad de los exosomas libres y cargados de dopamina en fibroblastos. Aunque los exosomas cargados de dopamina no demostraron ningún efecto citotóxico, la saponina disminuyó la viabilidad de los fibroblastos. El ensayo MTT mostró una mayor viabilidad celular cuando los fibroblastos fueron tratados con los exosomas cargados de dopamina.
La significación estadística de los resultados se evaluó mediante la realización de un anova de un factor. Además, se investigaron los efectos citotóxicos de diferentes concentraciones de exosomas libres en los fibroblastos. La viabilidad de los fibroblastos fue mayor con los exosomas libres a la concentración de 25 microlitros por mililitro.
Es muy importante para el sistema nervioso central el tamaño de los pacientes, el papel que desempeña en procesos como la plasticidad, la respuesta neurológica, la comunicación de lado a lado y la neurogénesis en el cerebro. Además, gracias a la superficie de los exosomas, se ha observado que pueden interactuar con el fármaco de la célula diana y la actividad administrada durante la finalización del fármaco. Por primera vez en el estudio, desarrollamos una nueva formulación de fármaco encapsulando la dopamina en exosomas derivados de células madre.
Propuso que esta formulación será muy prometedora para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
