Экзосомы могут реагировать на везикулы, секретируемые клеткой размером от 14 до 200 нанометров, и расщепляются во внутриклеточном грузе и коммуникациях, которые попадают в самую маленькую подгруппу внеклеточных везикул. Экзосомы, которые образуются в результате дифференцировки эндосомы, берут свое начало из клеточной мембраны. Стволовые клетки могут быть выделены из различных источников, таких как костный мозг или жировая ткань.
но взрослые высушенные стволовые клетки имеют более высокий иммуногенный потенциал Говорят, что они играют важную роль в заболеваниях центральной нервной системы, потому что они могут проникать через гематоэнцефалический барьер. Для начала промойте засеянные мезенхимальные стволовые клетки желе Уортона пятью миллилитрами PBS. Затем добавьте пять миллилитров раствора трипсина ЭДТА перед помещением колбы в инкубатор.
После инкубации собирают клетки и центрифугируют при 1,500 Г в течение пяти минут. Затем удалите надосадочную жидкость и добавьте в пробирку один миллилитр DMEM-F12, содержащего 10% FBS. Промыть культивируемые клетки PBS.
После промывки добавьте в клетки безсывороточную среду DMEM-F12 и поместите ее в инкубатор. Чтобы изолировать экзосомы, соберите свободную от сыворотки среду и центрифугируйте при 300 G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Перелейте надосадочную жидкость в другую пробирку и обработайте ее последовательным центрифугированием на более высоких скоростях.
После окончательного центрифугирования медленно удалите надосадочную жидкость и растворите гранулу в одном миллилитре PBS. Перемешайте вихревым способом и приступайте к ультрацентрифугированию при 110 000 G в течение 70 минут при температуре четыре градуса Цельсия. К суспензии экзосом, собранной ранее ультрацентрифугированием, добавляют три миллилитра PBS и стерилизуют разбавленную суспензию фильтрацией с помощью фильтра 0,22 мкм.
Затем переложите 500 микролитров стерилизованной суспензии экзосом в другую пробирку. Далее последовательно добавляют в стерилизованную суспензию 500 микролитров раствора дофамина и сапонина по 0,5 миллиграмма на миллилитр. После инкубации ультрацентрифугируют суспензию.
Образец может быть использован для анализа NTA и DLS для характеристики экзосом, нагруженных дофамином, или храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования. В анализе NTA средний размер экзосом, полученных из желе Уортона, был определен как 98 нанометров, а экзосом, загруженных дофамином, — 110 нанометров. Количество наночастиц, выявленных при анализе NTA и DLS, соответствовало друг другу.
Дзета-потенциал экзосом, полученных из желе Уортона, был измерен как минус 15,7, а экзосом, загруженных дофамином, как минус 17,6 милливольт. ВЭЖХ-анализ экзосом, нагруженных дофамином, выявил пик дофамина на 6,45-й минуте. Кумулятивный профиль высвобождения препарата показал, что 74,8% инкапсулированного дофамина было высвобождено из экзосом в течение первых восьми часов.
Исследована цитотоксичность дофаминовых и свободных экзосом на фибробластах. Несмотря на то, что экзосомы с дофаминовой нагрузкой не проявляли никаких цитотоксических эффектов, сапонин снижал жизнеспособность фибробластов. МТТ-анализ показал повышенную жизнеспособность клеток, когда фибробласты были обработаны экзосомами, загруженными дофамином.
Статистическую значимость результатов оценивали путем выполнения одностороннего анова. Кроме того, исследовано цитотоксическое действие различных концентраций свободных экзосом на фибробласты. Жизнеспособность фибробластов была выше у свободных экзосом в концентрации 25 микролитров на миллилитр.
Для центральной нервной системы очень важен размер пациента, играющий роль в таких процессах, как пластичность, нейрореакция, межвидовая коммуникация и нейрогенез в головном мозге. Кроме того, благодаря поверхности экзосом, было замечено, что они могут взаимодействовать с клетками-мишенями и проявлять активность, доставляемую во время приема препарата. Впервые в исследовании мы разработали новую лекарственную форму, инкапсулировав дофамин в экзосомы, полученные из стволовых клеток.
Он предположил, что эта формулировка будет столь перспективной для лечения болезни Паркинсона.
