Este protocolo permite estudiar el potencial y la capacidad de la glía de Muller para convertirse en células progenitoras de la retina después del tratamiento con factores específicos como microRNAs. La ventaja de esta técnica es que los candidatos de microARN pueden ser probados por su eficiencia y resultado antes de su uso en aplicaciones in vivo. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Seoyoung Kang, un estudiante de doctorado del laboratorio de Stefanie Wohl.
Primero, sumerja brevemente el globo ocular extraído en un tubo con etanol para evitar el arrastre de bacterias del animal. Luego, lave el globo ocular brevemente en la placa de Petri de 10 centímetros antes de colocarlo en la placa de 24 pocillos sobre hielo. Una vez que se hayan retirado y limpiado los globos oculares, coloque un ojo en el plato de disección colocado bajo un microscopio de disección con una fuente de luz.
Ahora fije un globo ocular agarrando el nervio óptico y el tejido conectivo circundante alrededor de la esclerótica con pinzas finas Dumont 5 y presiónelo cuidadosamente contra la placa de disección. Luego, haga un orificio en el centro de la córnea con una aguja de calibre 30 para permitir un acceso más fácil para las tijeras venosas. Luego, diseccione la córnea alrededor del cuerpo ciliar con tijeras venosas y retire cuidadosamente la córnea, el cristalino, el iris y el cuerpo vítreo con pinzas finas Dumont 5.
Posteriormente diseccionar la esclerótica con tijeras venosas hasta alcanzar el nervio óptico y extraer cuidadosamente la retina utilizando pinzas finas Dumont 5. Ahora use un segundo pinzas finas Dumont 5 para empujar contra la retina y eliminar completamente el cuerpo vítreo. Transfiera las retinas cortadas aproximadamente 2,5 centímetros de la punta de una pipeta de transferencia estéril para agrandar el diámetro.
Ahora, usando este consejo, recoja retinas enteras sin dañar el tejido y transfiera las retinas a una nueva placa de Petri estéril con HBSS frío y balancee el plato. A continuación, utilizando una nueva pipeta de transferencia estéril, empuje cuidadosamente las retinas para lavar las células epiteliales pigmentarias de la retina. Coloque inmediatamente la retina aislada en un nuevo pocillo limpio de la placa de 24 pocillos llena con un mililitro de HBSS mientras mantiene la placa de 24 pocillos en el hielo durante la disección.
Prepare la mezcla de disociación de la DNasa I de la papaína como se describe en el manuscrito. Ahora, con una pipeta de transferencia de punta agrandada, levante las retinas. Espere hasta que las retinas se asienten en la parte inferior de la punta y libere las retinas sin HBSS excesivo en el tubo que contiene la mezcla de papaína DNasa I.
A continuación, coloque el tubo en un nutator en la incubadora e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados y con 5% de dióxido de carbono. A continuación, disocie las células pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un mililitro. Después de disociar las células, agregue 275 microlitros de inhibidor de la proteasa ovomucoide del kit de disociación de papaína para neutralizar la papaína y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Coloque los tubos en una centrífuga y gire a cuatro grados centígrados durante ocho minutos a una fuerza centrífuga relativa de 300. Agregue el factor de crecimiento epidérmico al volumen calculado del medio de crecimiento precalentado a 37 grados centígrados. Retire los tubos con cuidado de la centrífuga.
Sin tocar el pellet en el fondo del tubo, retire el sobrenadante con cuidado y por completo. Ahora resuspender el pellet celular con 500 microlitros de factor de crecimiento epidérmico suplementado con medio de crecimiento. Luego, transfiera la suspensión celular a un pocillo de la placa de 12 pocillos etiquetada.
Enjuague el tubo con otros 500 microlitros del medio de crecimiento suplementado con factor de crecimiento epidérmico y agréguelo al pozo. Balancee la placa del pozo con cuidado y luego coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados con dióxido de carbono. Comience por verificar la confluencia celular del 90% al 100%.
A continuación, retire el medio y agregue un mililitro de HBSS frío para lavar el pozo. Balancee suavemente la placa y retire HBSS sin dejar rastros. Más tarde, agregue 500 microlitros de una solución que contenga tripsina precalentada para separar las células del pozo.
Rock suavemente e incubar durante dos minutos en una incubadora de 37 grados centígrados. Después de mover la placa de la incubadora al gabinete de bioseguridad, aspire la solución que contiene tripsina mientras se inclina. Dispersarlo cuidadosa y lentamente sobre el pozo varias veces hasta que las células se desprendan por completo.
A continuación, transfiera esta suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 mililitros y coloque los tubos en la centrífuga. Gire a 300 veces g durante ocho minutos a cuatro grados centígrados y vuelva a colocar los tubos en el gabinete de bioseguridad. Retire el sobrenadante sin tocar el pellet.
Ahora resuspenda cuidadosamente el pellet celular agregando 600 microlitros de medio de crecimiento precalentado y pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 30 a 40 veces. Finalmente, siembre 100 microlitros de la suspensión celular obtenida en el centro de seis cubreobjetos recubiertos de la placa de 24 pocillos. Coloque la placa en la incubadora y deje que las células se asienten para la transfección posterior utilizando micro imitadores de ARN.
La figura muestra las condiciones de control cinco días después de la transfección con algunas células positivas para Ascl1-Tomato presentes. Sin embargo, después de un tratamiento con miR-25, se encuentran muchas más células positivas para Ascl1-Tomato. La cuantificación reveló un aumento de cuatro veces en el número de células positivas para Ascl1-Tomato en los pocillos tratados con miR-25 en comparación con los controles.
Lo más importante es que la gran mayoría de las células positivas para Ascl1-Tomate encontradas en los pocillos tratados con riR-25 adoptaron una morfología neuronal. Las características de esta morfología neuronal incluían la reducción del tamaño del soma celular, el desarrollo de procesos finos y la formación de pequeñas redes. La cuantificación reveló que alrededor del 70% de todas las células positivas para Ascl1-Tomato tenían características neuronales.
El marcado inmunofluorescente muestra que las células positivas para Ascl1-Tomato con morfología neuronal expresan los marcadores neuronales OTX2 y MAP2, confirmando la identidad neuronal. La cuantificación de estas células reveló que después de la sobreexpresión de miR-25, alrededor de 40 neuronas positivas para Ascl1-Tomato por campo están presentes en comparación con cinco células neuronales por campo en los controles. Las células neuronales identificadas constituyen aproximadamente el 70% de la población total de células positivas para Ascl1-Tomate de las muestras tratadas con miR-25.
Además, la cuantificación del número absoluto de neuronas que coexpresan OTX2 y MAP2 mostró que después del tratamiento con miR-25, se encontraron alrededor de 60 neuronas por campo en comparación con 10 neuronas por campo en los controles. Es imperativo trabajar en un ambiente limpio y desinfectado con herramientas limpias y estériles y trabajar con cuidado evitando cualquier tratamiento severo. Las aplicaciones posteriores pueden ser, por ejemplo, cuantificación de proteínas, análisis de ADN o ARN, o estudios electrofisiológicos.
Esta técnica nos ayudó a explorar preguntas iniciales sobre la reprogramación nuclear que pertenece al campo de la medicina regenerativa. Y hay una larga gama de factores y condiciones que se pueden probar para explorar nuevas preguntas.
