Este protocolo es significativo, ya que le permite hacer inmunohistoquímica en el notum de la pupa de Drosophila, incluso después de haber sido previamente heridos, y con imágenes en vivo, sin interrumpir la arquitectura del tejido. Esta técnica permite aprovechar, de la amplia gama de tinciones de anticuerpos ya disponibles, para teñir células, estructuras y proteínas, en el epitelio notum. Hemos utilizado esta técnica para la inmunoquímica y la tinción de ADN.
Sin embargo, esta disección podría utilizarse como punto de partida para otras técnicas, como la hibridación in situ. Este protocolo puede ser difícil, porque las pupas son pequeñas y delicadas, por lo que requiere una mano firme para realizar la disección. Y se vuelve más fácil con la experiencia, así que practique en pupas sin importancia antes que en las importantes.
Comience retirando cuidadosamente de tres a cuatro pupas en la etapa P5, usando un endoscopio de disección, y recójalas en el portaobjetos del microscopio junto a la cinta. A continuación, coloque las pupas al menos a una pupa de ancho de distancia, sobre la cinta, con sus lados ventrales hacia abajo. Ahora, coloque una gota de pegamento adhesivo en una película de parrafina o en la tapa de un tubo de centrífuga.
A continuación, sumerja el extremo de una punta de pipeta de 0.1 a 10 microlitros en la gota de pegamento adhesivo y golpee la punta de la pipeta dos veces en un deslizamiento de cubierta, a un centímetro por un centímetro de distancia de una esquina, creando una línea de pegamento adhesivo, aproximadamente la mitad de la longitud de la pupa. A continuación, preestablezca una pipeta P2 en dos microlitros y una pipeta P200 a un volumen de 200 microlitros, y colóquelos con puntas. Ahora, inserte pinzas cerca del lado de la cabeza y retire suavemente la mayor cantidad posible de la caja de la pupila, trabajando desde la parte anterior hasta la posterior.
A continuación, agarre las patas en desarrollo de la pupa, con un par de fórceps contundentes, y retire cuidadosamente la pupa de su estuche. Coloque la pupa en la esquina del resguardo de la cubierta. Agarre la pupa en el abdomen posterior, o el ala en desarrollo, con fórceps romos.
Levante y coloque el lado ventral de la pupa hacia abajo, en la línea de pegamento adhesivo. Llene rápidamente la pipeta P2, con dos microlitros de PBS de una sola fuerza, que contienen calcio 0.1 milimolar, y manteniéndolo en el aire, expulse lo suficiente para formar una pequeña burbuja en la punta. Toque la pequeña burbuja de la solución, a un lado de la pupa en la base del tórax, luego repita el procedimiento en el otro lado.
A continuación, llene la pipeta P200, con 200 microlitros de PBS de una sola fuerza, con calcio 0.1 milimolar, luego coloque la punta de la pipeta sobre el tórax y expulse el contenido para sumergir las pupas por completo, y el resto del pegamento adhesivo se solidificará de inmediato. Ahora, retire aproximadamente 100 microlitros de la solución de PBS, de modo que la pupa apenas se sumerja, antes de proceder inmediatamente al siguiente paso. Para diseccionar el notum, agarre un par de tijeras de microdisección, sujetando un lado del mango contra el dedo índice y el dedo medio de la mano dominante, de modo que el pulgar de la mano dominante aplique la fuerza de corte.
A continuación, estabilice el cuello de las tijeras contra el dedo medio de la mano no dominante, mientras sujeta el deslizamiento de la cubierta, con el dedo anular de la mano no dominante. Ahora, corte en la mitad del abdomen dorsal para crear un pequeño orificio de aproximadamente 0.2 a 0.5 milímetros. Para aislar el tejido dorsal, haga pequeños cortes de 0,5 a 0,75 milímetros a través del tegumento, desde el posterior hasta el anterior, y al final, estos rodearán el tejido dorsal.
Además, repita los cortes posteriores a anteriores en el otro lado de las pupas. Gire la etapa de disección, para permitir un corte limpio a través de la cabeza si es necesario. Determine si el notum ha sido aislado, viendo si se mueve fácilmente.
Agregue aproximadamente 200 microlitros de PBS de una sola fuerza al centro del deslizamiento de la cubierta y haga un canal que lo conecte a la gota de disección original, arrastrando suavemente la punta de la pipeta a través del vidrio de la cubierta, desde la nueva gota hasta la original. Usando un par de pinzas romas, empuje o arrastre suavemente el notum aislado hasta el centro de la cubierta y gire, de modo que el lado interior mire hacia arriba. Sostenga el notum hacia abajo con fórceps contundentes, presionando en la sección abdominal o de la cabeza.
Usando un par de fórceps afilados y expulsiones suaves de PBS de una sola fuerza, de una pipeta de 200 microlitros, elimine cualquier cuerpo graso restante, bandas musculares o levantamiento de hemo, para exponer completamente el epitelio monocapa. Una vez que el tejido esté limpio, use una pipeta de 200 microlitros para eliminar la mayor cantidad posible de la solución de PBS, monitoreando con el endoscopio de disección, para evitar aspirar el notum. Después de la eliminación máxima del líquido, use un tejido absorbente para limpiar cuidadosamente el resto del pegamento adhesivo, la carcasa de la pupila y otros desechos en el resbalón de la cubierta.
Ahora, agregue de 150 a 200 microlitros de 4% PFA y fije durante 20 minutos a temperatura ambiente. Y dependiendo de la velocidad de disección, se pueden diseccionar de una a tres pupas más, durante la fijación de la primera pupa en deslizamientos de cubierta separados. Retire el PFA y reemplácelo con PBS de una sola fuerza, para lavar el notum una vez durante 30 segundos.
Si procede con la tinción de anticuerpos, realice tres lavados de cinco minutos, en PBS o PBST de una sola fuerza, para permeabilizar el tejido si el antígeno es intracelular. La muestra se puede almacenar en PBS de una sola fuerza, con azida de sodio al 0,02% durante la noche en una cámara humidificada. Después de la tinción, prepare un nuevo resbalón de cubierta conocido como topper, con soportes.
Cree un espacio de aproximadamente 200 micrómetros, mediante el uso de espaciadores hechos de 22 por 22 deslizamientos de cubierta, aproximadamente a un centímetro de distancia, en el medio del topper. Para adherirse, pinta la costura del espaciador más alejado del centro, con una capa delgada de esmalte de uñas, y luego déjalo secar. Retire la mayor cantidad posible de la solución acuosa de la muestra e inmediatamente aplique dos gotas de medio de montaje antidesvaneo a la muestra.
Si es necesario, use pinzas limpias y afiladas para colocar el notum en el centro de gotas medianas de montaje antidesvanecimiento. Coloque el resbalón de la cubierta con el notum, sobre un soporte de espuma de aproximadamente 10 por 40 milímetros para elevar la muestra para que no se adhiera a la superficie de trabajo. Bajo un endoscopio de disección, baje lentamente el topper sobre la muestra.
Una vez que el medio de montaje antidesvanecimiento se encuentre con el topper, suelte suavemente y permita que la acción capilar tire del topper hacia abajo. Coloque otra pieza de espuma sobre el topper y use un portaobjetos de microscopio estándar como peso, para persuadir suavemente el medio de montaje antidesvanecimiento entre el deslizamiento de la cubierta de la muestra, el topper y los espaciadores. Después de 5-10 minutos, use un tejido absorbente para absorber cualquier exceso de medio de montaje antidesvanecimiento, tocando suavemente los bordes del deslizamiento de la cubierta.
Aplique suavemente esmalte de uñas en cada esquina de los resbalones de la cubierta para adherirlos entre sí. Para evitar que el deslizamiento de la cubierta se desplace y dañe el tejido dorsal, evite primero el recubrimiento de los bordes y, una vez que el esmalte de uñas en las esquinas se seque, pinte todos los bordes de la cubierta para sellar. Este protocolo permite la toma de imágenes de las muestras fijas, utilizando anticuerpos y manchas celulares.
Este protocolo se puede utilizar en muestras que han sido previamente heridas y con imágenes en vivo. Una comparación de imágenes vivas y fijas, muestra que el protocolo preserva la arquitectura y morfología del tejido. El protocolo permite diferentes vistas de un notum diseccionado.
La vista apical es ideal para visualizar los bordes y núcleos de las células epiteliales, debajo de la cutícula. La vista basal revela mejor las estructuras basales en el margen de la herida. Asegúrese de no doblar o deformar el notum durante la disección.
Cortar una pieza plana evitando los bordes laterales. No corte demasiado cerca de los lados ventrales, de lo contrario se deformará durante el montaje. Después de diseccionar un notum de la pupila, se podrían aplicar muchas otras técnicas, como la microscopía electrónica y la sección transversal.
Estas técnicas podrían permitir que las estructuras previamente fotografiadas se investiguen con inmenso detalle.
