Dentro de los organismos multicelulares, el tejido muestra altos grados más en su orientación espacial. Las células alinean y muestran un rango de prioridad a grandes distancias en el transcurso de la morfogénesis. Para entender cómo se alcanzan los arreglos planos de la epitelia durante el desarrollo, es crucial rastrear las orientaciones de la célula y la dinámica de crecimiento con alta fidelidad temporal espacial in vivo.
El protocolo descrito está diseñado para imaginar y analizar los comportamientos celulares a nivel global y local en la epidermis pupal de drosophila. Esta metodología podría proporcionar información sobre diferentes teorías de la investigación, la biología celular, la morfogénesis y la polaridad plana y se puede aplicar al análisis de otros tejidos, estructuras y modelos. Todos los pasos se pueden realizar fácilmente después de un poco de práctica.
Exigen precisión. La visualización de este protocolo ayuda a lograr resultados óptimos en un tiempo más corto. La disección pupal es compleja.
Para comenzar, utilice un pincel humedecido para transferir pre-pupas blancas escenificadas a un vial de plástico fresco, y manténgalos allí durante el tiempo que sea necesario a 25 grados centígrados. A continuación, retire cada pupa de la pared del vial con la ayuda de fórceps. Pegue el lado ventral de cada pupa en una corredera de vidrio cubierta con cinta adhesiva de doble cara.
Toque suavemente sobre los espiráculos de la cabeza y la superficie dorsal de la pupa con las puntas de los fórceps para asegurar la adhesión de la caja pupal a la cinta. Comience la disección bajo un microscopio estéreo retirando suavemente el opérculo del puparium con los fórceps. Inserte una punta de los fórceps en un poco profundo entre la caja pupal y la superficie de la pupa a través de la abertura opercular.
Rasgar la caja de la cabeza a la cola lateralmente en uno o más columpios, evitando pellizcar la pupa. Dobla hacia atrás la caja pupal agrietada hacia los lados laterales mientras sigues avanzando hacia el extremo posterior. Retire la pupa de la caja de pupa abierta insertando cuidadosamente los fórceps debajo del animal y tirando suavemente hacia arriba.
La pupa se adhiere a la punta de los fórceps. Sostenga la pupa suavemente por el lado ventral, y transfiera la pupa a un plato con fondo de vidrio encima de una pequeña gota de aceite de halocarbono permeable al gas. Enrolle un pedazo de papel de tejido húmedo en los bordes del plato y cubra el plato para mantener la humedad.
Orientar la pupa sobre la gota de aceite en los platos con fondo de vidrio de acuerdo con el dominio y el proceso a evaluar. Para la toma de imágenes vivas a largo plazo de la expansión temprana de los nidos dorsales, orientar dorsalmente la pupa. Para imaginar su expansión tardía y remodelación de tejidos, oriente dorsalmente la pupa.
Transfiera el plato de fondo de vidrio que contiene las pupas montadas a la etapa del microscopio y concéntrese en la superficie de la zona abdominal utilizando luz transmitida. Para emplear la recombinación mitótica para inducir mosaicos genéticos en el epitelio abdominal, prepare hembras vírgenes portadoras de una flipasa inducible por choque de calor, un sitio de FRT en un lugar genómico específico y un marcador celular distal reconocible para el sitio FRT. Preparar machos mutantes que lleven un sitio FRT en el lugar genómico equivalente.
Cruzar varias hembras y machos en una proporción de tres a uno en un vial de plástico a 25 grados celsius durante cuatro a cinco días. Para generar clones somáticos en los histoblastos, realice un tratamiento de choque térmico en la tercera etapa larval instar de la progenie de la cruz sumergiendo los viales de plástico que contienen a los animales en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 45 minutos a una hora. En el software de imagen J, utilice la función de proyección de intensidad máxima para proteger las rebanadas de pila Z adquiridas por microscopía confocal en 2D.
Los nidos tienen una forma característica que los orienta en un sistema de coordenadas planas anterior a la izquierda y dorsal a la parte superior. Para lograr resultados óptimos con este análisis, la imagen de entrada tiene que ser adquirida con alta resolución. Para obtener valores de orientación cualitativos en los bordes de celda locales, haga clic en el menú del complemento y elija la opción de distribución J de orientación.
Establezca el sigma de la ventana gaussiana en un píxel, spline cúbica en degradado, coherencia mínima en 20 por ciento y energía mínima en un uno por ciento. Utilice la opción de encuesta de color del complemento. Establezca el tono en orientación, saturación en coherencia y brillo para la imagen de entrada.
Este color codifica las orientaciones de arista de celda en relación con el sistema de coordenadas planas establecido. A continuación, en el menú del complemento, utilice la opción de medida J de orientación para cuantificar las orientaciones celulares y la alineación de celda a celda direccional. Generar regiones pequeñas, adyacentes no superpuestas de interés de peso uniforme alrededor de 20 micrómetros por 20 micrómetros dentro del área ocupada por los histoblastos.
La medida de prensado calcula la orientación local dominante y la coherencia de los ROI. En este estudio, la metodología utilizada es capaz de generar películas de alta resolución de las pupas en desarrollo durante períodos de hasta 48 horas sin blanqueo fotográfico significativo o toxicidad fotográfica. Aquí se muestran ejemplos de clones de tipo salvaje marcados por la ausencia de RFP NLS y sus puntos gemelos a las 26 horas posteriores a la formación del puparium.
Los clones alargados a lo largo de los límites segmentarios. Clones gemelos dispuestos en paralelo o en tándem. La morfología de un clon de tipo salvaje a las 26 horas y 47 horas después de la formación del puparium muestra una morfología fronteriza compleja en ambas etapas.
Las gráficas de caja y bigote para parámetros geométricos a las 26 horas y 47 horas después de la formación del puparium muestran que el área promediada y el perímetro aumentaron significativamente en esta ventana de tiempo. La orientación del clon se sostuvo durante la expansión y remodelación. Los parámetros de forma a las 26 horas y 47 horas después de la formación del puparium indican la rugosidad, redondez y circularidad apenas cambiadas en los clones de tipo salvaje.
Asegúrese de no dañar la pupa, de lo contrario morirá en unas pocas horas, afectando las imágenes en vivo. Este protocolo no requiere el empleo de un reactivo o instrumento de sartus. Evite pellizcarse al diseccionar.
Mediante la aplicación de estas metodologías posibles para generar películas de alta resolución para períodos de largo plazo utilizando diferentes técnicas de imagine. Focal a fotones o discos giratorios. El análisis cloral se puede emplear para explorar las respuestas no autónomas ya que las células aleatorias facilitan la identificación de conversaciones cruzadas o mecanismos de comunicación celular.
Estos métodos se pueden adaptar fácilmente para estudiar una gama completa de fenómenos morfogenéticos, incluyendo la coordinación de epidérmica, muscular, y desarrollo neuro durante la metamorfosis.
