Este protocolo describe un método para la visualización y cuantificación in vivo y tridimensional de las células que retienen etiquetas del nicho de células madre incisivas de ratón. Esta técnica ahorra tiempo y es fácil de usar para los nuevos estudiantes. Las imágenes 3D se adquieren sin dañar el tejido.
La cuantificación 3D hace que los datos sean más fiables y precisos. Para empezar, disecciona las mandíbulas. Fijar las muestras en paraformaldehído al 4% y mantenerlas a temperatura ambiente durante la noche.
Después de la incubación, retire los músculos de las mandíbulas. Sumérjalos en una solución de ácido etilendiaminotetraacético 0,5 molares para descalcificar durante cuatro días con un cambio medio diario en una agitadora de 37 grados centígrados. Decolorar las mandíbulas en 15 mililitros de solución de 25% Quadrol en un agitador de 37 grados centígrados durante un día para eliminar el hemo sanguíneo restante.
Para la tinción de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina de montaje entero, prepare un cóctel fresco de etiquetado de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina como se menciona en el texto. Enjuague las mandíbulas con una solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 o PBST durante 30 minutos en una coctelera de 37 grados centígrados. Repita el enjuague de las mandíbulas con solución salina tamponada con fosfato tres veces durante tres minutos cada una, seguido de la incubación en un cóctel de etiquetado de 5-etinil-2-desoxiuridina recién preparado en una coctelera durante la noche.
Repita el lavado salino tamponado con fosfato tres veces y realice la deslipidación en serie colocando las mandíbulas en las soluciones mencionadas en el texto durante seis horas cada una en un agitador de 37 grados centígrados. Deshidratar las mandíbulas en solución de terc-butanol-polietilenglicol, o tB-PEG, durante dos días a 37 grados centígrados con el cambio medio diario. Después de dos días, limpie la mandíbula en un medio de limpieza de benzoato de bencilo-polietilenglicol que contenga 75% de benzoato de bencilo, 22% de metacrilato de polietilenglicol-metil-éter promedio 500 o PEG-MMA500, y 3% de Quadrol para obtener la coincidencia del índice de refracción y hasta que se logre la transparencia.
Monte la mandíbula entera despejada de tejido en portaobjetos de cavidad de marca en el medio de limpieza de benzoato de bencilo-polietilenglicol y cúbrala con portaobjetos de cubierta de vidrio. En el software de imágenes confocales, establezca los parámetros de adquisición de imágenes deseados. En el panel para excitación fluorescente, active el láser necesario para excitar los fluoróforos de manera óptima.
En el panel para la detección de fluorescentes, mueva el control deslizante para seleccionar las longitudes de onda que se van a medir. Agregue una gota de aceite de inmersión con un índice de refracción de 1.52 en la parte superior del cubreobjetos para que coincida con el índice de refracción del cubreobjetos de vidrio y el objetivo, y coloque la mandíbula montada en la etapa del microscopio. Encienda las lámparas fluorescentes y elija un objetivo de ampliación adecuado para obtener imágenes de las regiones de interés.
En el modo de escaneo en vivo, identifique el campo de visión para visualizar toda la región de la mandíbula en las dimensiones X e Y. Establezca los parámetros de adquisición de la etapa Z superior e inferior que cubran con precisión el volumen del nicho de células madre en el incisivo de los ratones. Utilice un tamaño de paso Z de dos micrómetros o según sus requisitos.
Adquiera y guarde archivos de imagen Z-stack en formato lif. Utilice un convertidor de archivos de software de imágenes para convertir el archivo de imagen Z-stack al tipo de archivo de formato nativo. En el software de imágenes, haga clic en el botón Arena y, a continuación, seleccione Imagen.
Seleccione el archivo lif original y elija el archivo combinado. Las imágenes se importarán al software de imágenes. Haga doble clic en el archivo importado para abrir el conjunto de datos de imagen.
En el software de imágenes, visite el panel Ajuste de pantalla. En el panel Ajuste de pantalla, haga clic en el nombre del canal. Por lo general, se etiqueta como rojo en el modo predeterminado.
En la ventana Propiedades de imagen, haga clic en la pestaña Color asignado. En la opción Color Tab File, elija Fire Flow y luego haga clic en OK. Seleccione el color de la pantalla para distinguir la fluorescencia de fondo y la fluorescencia positiva de la muestra. En la parte superior izquierda de la pantalla, en el panel Propiedades de escena, haga clic en el icono azul con la etiqueta Agregar nueva superficie.
Anule la selección del icono Volumen para eliminar la mayor parte de la fluorescencia de fondo, lo que da como resultado la fluorescencia positiva claramente visible durante la segmentación manual. A continuación, inicie la segmentación manual de la región de interés, o ROI, haciendo clic en la pestaña Crear y seleccionando la pestaña Omitir creación automática, editar manualmente. En el asistente de creación manual de superficies, haga clic en la pestaña Contorno para elegir la orientación basada en las muestras para contornear el ROI fácilmente.
A continuación, asegúrese de que el menú del puntero en la esquina derecha esté en modo Seleccionar. Ajuste la posición del corte para localizar el ROI en el tejido. Como se mencionó anteriormente, la mayor parte de la fluorescencia de fondo ya se ha eliminado.
Haga clic en el botón Dibujar y dibuje una región tentativa de interés. Seleccione la opción Visibilidad en Ninguno para evitar interferencias de otras áreas que no sean ROI, seguido de segmentar la región de interés segmento por segmento. Una vez finalizado el dibujo del ROI, haga clic en Crear superficie para obtener una geometría 3D del ROI.
Haga clic en el botón Editar del asistente de creación manual de superficies y seleccione Enmascarar todo. En la ventana emergente Canal de máscara, seleccione Canal 1 en las opciones de Selección de canales. Después, seleccione Duplicar canal antes de aplicar la máscara.
En la configuración de la máscara, seleccione Constante interior/exterior y establezca la superficie exterior del vóxel en cero. En el panel Propiedades de escena, anule la selección del objeto Surface y seleccione el objeto Volumen. En Ajuste de pantalla, anule la selección del canal rojo original y seleccione el canal rojo enmascarado.
Y ajuste las intensidades de color para obtener el ROI de fluorescencia deseado renderizado en 3D y etiquetado positivamente. Cree un nuevo objeto de spot haciendo clic en el icono Spots para cuantificar las celdas de retención de etiquetas renderizadas en 3D creando manchas 3D que se superponen de forma comparable con las celdas de retención de etiquetas renderizadas en 3D. Utilice las flechas inferiores para desplazarse entre los pasos del asistente para la creación de puntos.
Haga clic en el botón Finalizar y seleccione el botón Estadística. A continuación, seleccione la pestaña General para encontrar el valor del número total de puntos en la imagen. Después del marcado de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina y el proceso de limpieza tisular del sistema solvente asociado al polietilenglicol, se obtuvo la mandíbula transparente.
La muestra modificada se comparó con una mandíbula normal sin un proceso de limpieza de tejido, y una mandíbula transparente con marcado de 5-etinil-2-prime-desoxiuridina se sometió a imágenes confocales. La sección óptica del incisivo mostró células que retienen la etiqueta en el nicho de células madre del ápice incisivo en el plano XY. La construcción de la imagen 3D de un ápice incisivo mostró células madre quiescentes positivas de retención de etiquetas 5-etinil-2-prime-desoxiuridina tanto en el nicho de células madre epiteliales como mesenquimales.
Las células positivas para 5-etinil-2-prime-desoxiuridina se transfirieron a puntos para la cuantificación que se superpusieron de manera comparable con las células mesenquimales que retienen la etiqueta. Las manchas creadas solo para las células mesenquimales que retienen etiquetas y solo para las células epiteliales que retienen etiquetas son visibles en la imagen. También se realizó la cuantificación de las células que retienen el marcador epitelial y mesenquimal.
Las propiedades para el procesamiento y la limpieza son los pasos más importantes y deben optimizarse de acuerdo con el uso del tejido para obtener resultados satisfactorios. Este método también se puede modificar para visualizar LRC de nivel S2VGFP y en el rastreo de linaje celular para obtener detalles sobre la ubicación de la progenie y su cuantificación o contribuciones.
