Damos las gracias al Sr. Douglas Benson para las conversaciones iniciales con respecto a la imagen secundaria del paladar. También reconocemos a David Castaneda-Castellanos (Leica) y Chris Rieken (Zeiss) por su ayuda para ajustar las condiciones de imagen en microscopía confocal. Agradecemos a Lynsey Hamilton (Bitplane) por sugerencias útiles para el análisis cuantitativo de imágenes usando el software Imaris. Este trabajo fue financiado por NIH / NIDCR R01 DE025887.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos de la Universidad de California en San Francisco Cuidado de Animales institucional y Comité de Uso. 1. Preparación de medios de imagen en vivo <ol><li> Preparación de medios de cultivo líquidos <ol><li> Añadir 20% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mu g / ml de estreptomicina, 200 mu g / ml de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES a Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium medios de comunicación. NOTA: Los medios de imagen en vivo se han fabricado justo antes de la obtención de imágenes. Este medio contiene fenol-rojo que puede conducir a la fototoxicidad a lo largo de cursos de tiempo de imágenes en vivo. La sustitución de los medios sin rojo de fenol puede mejorar la imagen a largo plazo. </li></ol></li><li> Preparación de solución de agarosa de bajo punto de fusión <ol><li> Disolver 350 mg de agarosa de bajo punto de fusión en 10 ml de agua destilada en autoclave para obtener una solución madre al 3,5%. </li><li> Mezclar el pocillo de la solución de agarosa e incubar a 70 ° C en un baño de agua para disolver completamente la agarosa. </li><li> Enfriar la solución de agarosa en un baño de agua a 37 ° C antes de añadirlo a los medios de imagen en vivo. </li><li> Añadir 1 ml de la solución madre de agarosa a 5 ml del medio de formación de imágenes en vivo líquido para obtener una concentración final (0,6%). </li><li> Mantenga el medio con agarosa en un baño de agua a 37 ° C para evitar la solidificación prematura. </li></ol></li></ol> 2. Preparación del cultivo de explantes de paladar para imágenes en directo <ol><li> Disección de estanterías palatales secundarias E14.5 recientemente adheridas NOTA: En nuestra experiencia, la fusión de imágenes requiere comenzar con un par ligeramente adherido de estantes palatales; Esta adherencia evita movimientos de explante que evitan que se produzca fusión durante la formación de imágenes. <ol><li> Dissect E14.5 embriones etapa en 1 x salino fosfato-tamponado (PBS) y elegir la proteína fluorescente verde (GFP) -expresando (deK14 - cre; ROSA26-mTmG flox ) o (proteína fluorescente roja) que expresan RFP (de Lifeact-mRFPruby ) embriones positivos utilizando un microscopio de disección equipado con lámparas fluorescentes. Transferir el tejido a medios de cultivo de imagen viva precalentados sin agarosa. </li><li> Corte la cabeza del embrión y retire el área superior del cerebro usando dos pinzas finas No. 5 ( Figura 1 A-C ). Utilice una pinza No. 5 para sostener el embrión mientras que la otra pinza No. 5 cortará el tejido adicional fuera de los estantes palatales. NOTA: Las tijeras finas se pueden utilizar para cortar la cabeza del embrión (el primer paso) en vez de una pinza No. 5. Sin embargo, dos fórceps finos No. 5 darán un mejor control para hacer cortes precisos. </li><li> Retire la mandíbula cuidadosamente sin dañar las estanterías palatinas como se muestra en la Figura 1 D y 1E . Para reducir la posibilidad de dañar los paladares, mantener la lengua a través de la disección de la mandíbula, fOllowed por la eliminación cuidadosa de la lengua. </li><li> Después de retirar la mandíbula y la lengua, examinar el lado oral del paladar secundario con un estereomicroscopio con fluorescencia para confirmar la señal de un reportero fuerte en el MES ( Figura 1 M ). </li><li> Disecar las partes posteriores, incluyendo el trasero y el tronco cerebral después de extraer la mandíbula y la lengua ( Figura 1 F ). </li><li> Retire ambos maxilares con estantes palatinos adheridos ( Figura 1 G ). </li><li> Corte el tejido anterior de la mandíbula superior manteniendo intacto el paladar primario y secundario ( Figura 1 H e I ). </li><li> Quitar el tabique nasal en el lado nasal del explante exponiendo el MES. NOTA: Estos pasos posteriores de las disecciones necesitan una atención cuidadosa para no interrumpir los contactos entre dos estantes palatales secundarios. La extirpación del tabique nasal ayuda aReducir la señal de fondo de otras áreas y también reducir el movimiento vertical del tejido, lo que permite una imagen estable ( Figura 1 J-L ). </li><li> Después de diseccionar las estanterías palatales, examine nuevamente la señal del reportero de la línea media para asegurarse de que no haya daños en la capa epitelial entre los tejidos. </li></ol></li><li> Preparación de explantes de paladar en un plato de cultivo con medios de imagen en vivo <ol><li> Coloque los medios de imagen en vivo en un plato inferior de vidrio de 35 mm. </li><li> Coloque los estantes palatales disecados con el lado oral hacia abajo, lo más cerca posible del fondo de vidrio, para obtener imágenes con un microscopio confocal invertido ( Figura 1 N ). </li><li> Coloque pastillas de hielo seco en una superficie conductora cerca de la placa de cultivo para acelerar la solidificación de agarosa disminuyendo rápidamente la temperatura o poner la cápsula de cultivo a 4 ° C. Una placa fría, como la que se utiliza para la incrustación de parafina también podría ser utilizado en este sTaje NOTA: Cuando se usa hielo seco, el cambio de los medios de agarosa necesita ser monitoreado cuidadosamente para prevenir el congelamiento de los medios. </li></ol></li></ol> 3. Confocal Time-lapse Imaging de Palate Explant <ol><li> Imaging y adquisición de datos <ol><li> Después de semi-solidificar la agarosa, montar el plato de cultivo en un microscopio confocal invertido equipado con cámara de incubación a 37ºC. Utilice un microscopio confocal de luz blanca y un microscopio confocal de disco giratorio de observador de células. NOTA: Utilizamos un medio modificado que contenía HEPES 15 mM sin gas CO 2 . </li><li> Colocar vaselina entre el plato de cultivo y cubrir con una jeringa para evitar la evaporación de los medios de comunicación ( Figura 1 N ). NOTA: Se produce algo de condensación en la parte superior de la cubierta del plato de cultivo después de un cultivo durante la noche (O / N), pero el volumen de medio no cambia, lo que sugiere que la vaselina evita que los medios se evaporen. </li><li> Localice la región de interés con objetivos de ampliación baja (10x) y utilice objetivos de ampliación más altos (objetivo 20x con zoom digital de 3x o objetivo de 40x con Immersol W) para imágenes en tiempo real. NOTA: Los estantes palatales secundarios disecados no son planos. El paladar secundario es una estructura curvada y esto hace que sea difícil imaginar el MES completo en el mismo plano. Las imágenes de baja ampliación (10x) pueden permitir imágenes en paladar completo, pero los objetivos 40x proporcionarán una mejor resolución de imagen para examinar los movimientos celulares detallados en posiciones Z más profundas. La curvatura es alta en la región del paladar medio. El paladar anterior y posterior son relativamente planos en comparación con el paladar medio. A menudo nos fijamos en la mitad anterior del paladar secundario para evitar las regiones de mayor curvatura. </li><li> Escanear múltiples pilas Z con 5 μm cada paso durante 16-24 h usando la excitación láser apropiada (488 nm para GFP y 532/561 nm para RFP) ( Figura 2 ). NOTA: Para reducir la fototoxicidad potencial, use la potencia láser mínima y el tiempo de exposición. Esto es importante especialmente en el caso de imágenes multicolor. Utilice un 22% de potencia láser de 552 nm para membranaTomato (mT), un 30% de potencia láser de 495 nm para membranaFPG (mG) y un 25% de potencia láser de 561 nm para membranaRFP. El tiempo medio de exposición fue de 550 ms. </li><li> Utilice el software de análisis de imágenes para realizar seguimiento celular y análisis cuantitativo. </li></ol></li></ol> 4. Análisis de la imagen de datos NOTA: Aquí, Imaris fue utilizado. Análisis de datos similares también pueden realizarse con paquetes de software ImageJ o Volocity. <ol><li> Representación de superficies tridimensionales (3D) a partir de secuencias de imágenes. NOTA: Esta sección permite generar una superficie a partir de una película generada con una señal GFP de membrana. <ol><li> Haga clic en Editar | Muestre el ajuste de la pantalla y utilice el deslizador del histograma para ajustar la intensidad de la señal de modo que la señal de membrana quede clara a través deLa duración de la película ( Figura 3 A ). </li><li> Corregir la señal blanqueada utilizando Image Procesamiento | Corrección de atenuación . Ajuste los valores Intensity Front (Frente de intensidad) e Intensity Back (Retorno de intensidad) para que la señal de membrana se aclare a lo largo de la película. Es posible que se requieran algunas pruebas y errores al establecer estos valores. NOTA: El valor de Intensity Back (posición de profundidad Z) será menor que el valor de Intensity Front (superficie Z) debido a la penetración limitada del láser. Estos valores también pueden cambiarse para normalizar la intensidad de la señal en la serie Z. Ambos valores pueden ajustarse para lograr la corrección de blanqueo. La corrección de atenuación también se denomina corrección de atenuación de emisiones 19 . </li><li> Con el fin de generar una superficie a partir de la señal de membrana, seleccione Surpass | Superficies , elija un canal de origen y un tipo de Umbral (Intensidad absoluta) y bajo los ajustes de algoritmoLección Segmente sólo una Región de Interés Y Proceso de la imagen entera finalmente , seguido haciendo clic en la flecha hacia adelante; Continúe presionando la flecha hacia adelante (utilice la configuración predeterminada o especifique los niveles de detalle de superficie y el método de umbral por ensayo y error), verificando si la superficie generada refleja la señal de fluorescencia. Para especificar una Región de Interés, seleccione la región y la (s) hora (s) a renderizar recortando las posiciones X, Y, Z. NOTA: Seleccione Proceso de toda la imagen finalmente para que los ajustes y los umbrales se apliquen a través de toda la película. </li><li> Genere una superficie haciendo clic de nuevo en el botón de flecha hacia delante. A continuación, ajuste el umbral cambiando el histograma en Filtros para que corresponda a la señal de membrana. </li><li> Después de que se genera la superficie, elija superficie en Superficies / Ajustes para visualizar la señal de superficie y terminar el proceso de generación de superficie empujando el doble remolqueArd ( Figura 3 B ). </li><li> Ir a la superficie | Edite y haga clic en Mascarar todo en las propiedades de máscara para generar una imagen de canal enmascarada. </li><li> Después de hacer clic en Aceptar, la ventana Canal de máscara se abrirá automáticamente; Seleccione el canal GFP, ajuste los voxels fuera de la superficie al valor máximo de intensidad de la señal (que se encuentra en el ajuste Edit | Display ) y voxels dentro de la superficie al valor mínimo de intensidad GFP (también encontrado en Editar | Ajuste de la pantalla ), en Ajustes de máscara para generar una máscara de la señal de membrana. </li><li> Como la máscara de la señal de membrana se mostrará en la vista de volumen , generar imágenes invertidas mediante el procesamiento de imágenes | Cambio de Contraste | Invertir ( Figura 3 C ). </li></ol></li><li> Detección de manchas de imágenes de superficie invertida. NOTA: Esta sección permite que el centro de cada celda seaMarcado con un lugar único y rastreado sobre el espacio y el tiempo. <ol><li> Seleccione Surpass Scene | Spots | Crear ; En Ajustes de Algoritmo seleccione Segmento sólo una Región de Interés , Proceso de toda la imagen finalmente y Puntos de Pista (con el tiempo) . </li><li> Haga clic en la flecha hacia adelante y especifique una región de interés; Seleccione la región y la (s) hora (s) para rastrear los puntos; Continúe presionando la flecha delantera, elija el canal enmascarado como canal fuente y determine el diámetro estimado de puntos XY. </li><li> Al hacer clic en el botón de flecha hacia adelante se abrirá automáticamente una ventana de filtro; Ajustar el umbral de detección de puntos cambiando los valores en el histograma para generar puntos únicos en el centro de cada celda ( Figura 3 D ). </li><li> Al hacer clic de nuevo en el botón de flecha hacia delante, se abrirá la ventana de Algoritmo ., Seleccione el modelo de seguimiento de movimiento automático 20 y especifique los datos de seguimiento máximoY el tamaño máximo de hueco para conectar las vías que se convierten en discontinuas durante un corto período de tiempo. </li><li> Al hacer clic de nuevo en el botón de flecha hacia delante se abrirá la ventana Filtros, establezca el umbral de duración de pista ajustando el histograma para que cada celda sea rastreada. Al hacer clic en el botón de flecha de avance doble se finalizará la detección de puntos. </li><li> Para corregir la deriva de tejido, haga clic en Spots | Track Editor y seleccione Correct Drift . Se abrirá automáticamente una ventana Algoritmo ; Seleccione la opción Derivación translacional, Incluir resultado completo y Posiciones correctas de objetos . </li></ol></li><li> Generación de parcelas ventajosas para el análisis cuantitativo. NOTA: El Scatterplot del programa es una herramienta para generar gráficos multidimensionales (X, Y, Z, Color y Escala) con múltiples objetos. Estas parcelas son útiles para ver las tendencias de muchos movimientos celulares en el tiempo. <ol><li> Realice tramas 2D o 3D de datos de seguimiento de celdasVantage-Añadir nuevo menú de trazado Vantage ( Figura 3 E y 3F ). </li><li> Seleccione Volume o Spots y elija Create / Category y Plot Type </li><li> Ajuste los valores de trazado para generar diferentes gráficos de Vantage. </li><li> Exportación de gráficos mediante la función Snapshot . NOTA: Los datos estadísticos también se pueden exportar como una hoja de cálculo para un análisis cuantitativo adicional haciendo clic en Área de números de trazado | Guardar . </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Imágenes en vivo de la morfogénesis del tejido con el cultivo de explante de órganos 3D puede proporcionar información detallada sobre los procesos celulares que no se puede mostrar en el análisis de tinción convencional de secciones de tejido fijo. Utilizando cultivo de explantes in vitro de paladar secundario embrionario de ratón, se observaron varios comportamientos celulares interesantes que nos llevaron a proponer un nuevo mecanismo de fusión del paladar que implica la convergencia epitelial y la e...

La fusión de tejidos es un paso importante en el desarrollo de múltiples órganos. Los principales defectos de nacimiento humanos, tales como labio leporino y paladar hendido, espina bífida y malformaciones del corazón pueden ser resultado de defectos en la fusión de tejidos 1 . La fusión del paladar secundario del ratón ha sido ampliamente estudiada para identificar los mecanismos celulares y moleculares que controlan la fusión de tejidos en el desarrollo 2 , 3 , 4 . En el ratón, el desarrollo del paladar secundario comienza alrededor de E11.5 con el crecimiento de un estante palatino secundario de cada uno de los procesos maxilares bilaterales. El crecimiento inicial de los estantes palatales se produce verticalmente a lo largo de la lengua, hasta aproximadamente E14.0, momento en el cual los estantes palatales se elevan horizontalmente por encima de la lengua. El crecimiento medialmente dirigido da como resultado el contacto físico entre los epitelios de las dos estanterías palatinas, formando el epitelio de la línea mediaAl costura (MES) en E14.5. El MES intermedio debe ser removido de entre los estantes palatales secundarios para permitir la confluencia mesenquimal y el desarrollo de un paladar secundario intacto, completamente fusionado por E15.5 3 . La forma en que se forma una capa epitelial compartida de células MES entre dos estantes palatales separados, y luego se eliminan para lograr la confluencia mesenquimal, ha sido una cuestión central en el desarrollo del paladar. Basado en estudios histológicos y de microscopía electrónica de ratón (EM), estudios de cultivos de explantes y experimentos genéticos de ratón, varios comportamientos celulares fundamentales han sido implicados en este proceso. Las proyecciones de tipo filopodia del epitelio del borde mediano MEE de cada estante palatino facilitan el contacto inicial 5 , 6 , seguido de la intercalación de estas células epiteliales a una MES única compartida 6 , 7 . Eliminación de la MES compartida resultanteHa sido propuesto para proceder por tres mecanismos no exclusivos. Los primeros estudios que emplean observación histológica y ex vivo linaje rastreo con colorantes vitales indicaron que las MES pueden ser removidos por transición epitelial a mesenquimal (EMT) de células MES 8, 9, aunque más recientemente, genética rastreo de linaje de las células epiteliales ha planteado incertidumbre en cuanto a La contribución a largo plazo de las células epiteliales al mesénquima del estante palatal 10 , 11 , 12 . Un número significativo de células apoptóticas, y una reducción en su número en algunos mutantes que no se someten a la fusión adecuada paladar ha llevado a la idea de que la apoptosis puede ser un importante conductor de MES disolución [ 2 , 3] . Finalmente, basándose inicialmente en estudios con etiquetado epitelial y observación estática en puntos de tiempo progresivos, las células MESSe propusieron migrar en las dimensiones oronasal y anteroposterior 11 , 13 , pero estos comportamientos celulares dinámicos fueron inicialmente no confirmados debido a la incapacidad de observarlos en tejido palatino vivo. Recientemente, hemos sido capaces de observar directamente estos comportamientos mediante el desarrollo de una nueva metodología de imagen en vivo que combina los métodos genéticos de ratón de marcado fluorescente con confocal imágenes en vivo de estantes palatales explantados. Primero, para visualizar los comportamientos celulares dinámicos en las células epiteliales del paladar durante la fusión del paladar, se generó un ratón reportero epitelial específico cruzando ROSA26- mTmG ratones flox con ratones Keratin14-cre 14 , 15 . Confocal imágenes en vivo del cultivo de explante paladar de los embriones resultantes confirmó algunos propuesto anteriormente los comportamientos celulares e identificaron nuevos eventos en el proceso de fusión 6 </Sup Las protrusiones de la membrana de las células epiteliales precedieron al contacto inicial célula-célula, seguido por la convergencia epitelial por intercalación celular y desplazamiento celular oronasal. En particular, también descubrió que la extrusión celular, un proceso que se informó que desempeñan un papel importante en la homeostasis epitelial, fue un importante mecanismo de conducción del ratón paladar secundario fusión 6 , 16 . Este método de formación de imágenes se puede usar con otras líneas de reportero; Utilizamos Lifeact-mRFPruby ratones transgénicos 17 , 18 para examinar la dinámica del citoesqueleto actina durante el proceso de fusión. También se pueden emplear otros reporteros para observar otros aspectos específicos de la fusión del paladar y este método puede adaptarse a microscopía confocal de barrido láser o microscopía confocal de disco giratorio, dependiendo de las necesidades de formación de imágenes y de la disponibilidad del microscopio. La imagen en vivo se está convirtiendo cada vez más en un enfoque clave en la biología del desarrollo. PartiCularmente, la morfogénesis craneofacial es compleja y los defectos congénitos humanos que afectan la cara son comunes. Este método confocal de imágenes en vivo ayudará a permitir una mejor comprensión de los mecanismos básicos de desarrollo subyacentes, así como los orígenes de las anomalías craneofaciales humanas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

La fusión de los estantes palatales secundarios para formar el paladar secundario intacto es un proceso clave en el desarrollo de los mamíferos y su alteración puede conducir a la hendidura del paladar secundario, una anomalía congénita común en los seres humanos. La fusión del paladar secundario ha sido ampliamente estudiada conduciendo a varios mecanismos celulares propuestos que pueden mediar en este proceso. Sin embargo, estos estudios se han realizado principalmente en tejidos embrionarios fijos en puntos de tiempo progresivos durante el desarrollo o en cultivos de explantes fijos analizados en puntos de tiempo estáticos. El análisis estático es limitado para el análisis de los procesos morfogenéticos dinámicos tales como una fusión del paladar y qué tipos de comportamientos celulares dinámicos median en la fusión palatal se entiende incompletamente. Aquí se describe un protocolo para la imagen en vivo de fusión de paladar secundario ex vivo en embriones de ratón. Para examinar los comportamientos celulares de la fusión del paladar, Keratin14 -cre específico epitelial se utilizó para etiquetar las células epiteliales del paladar en ROSEmbriones reporter flox A26-mTmG. Para visualizar la actina filamentosa, se utilizaron ratones reporteros Lifeact-mRFPruby . La imagen en vivo de la fusión del paladar secundario se realizó mediante la disección de estanterías palatales secundarias recientemente adheridas de embriones embrionarios de día (E) 14.5 y el cultivo en medios que contenían agarosa en un plato inferior de vidrio para permitir la formación de imágenes con un microscopio confocal invertido. Usando este método, hemos detectado una variedad de nuevos comportamientos celulares durante la fusión palatina secundaria. Una apreciación de cómo distintos comportamientos celulares se coordinan en el espacio y el tiempo contribuye en gran medida a nuestra comprensión de este proceso dinámico morfogenético. Este protocolo se puede aplicar a líneas de ratones mutantes, o cultivos tratados con inhibidores farmacológicos para avanzar en la comprensión de cómo se controla la fusión de paladar secundaria.

La visualización en vivo del cultivo de explantes de paladar reveló múltiples procesos celulares que median la fusión del paladar 6 . Los contactos iniciales entre dos células epiteliales se hacen por protrusiones de membrana ( Figura 2 B-2E ). Cuando dos capas epiteliales se encuentran, forman una MES multicelular, seguida de intercalación para formar una MES de capa celular integrada a través de la convergenc...

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Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Aquí, presentamos un protocolo para la imagen en vivo de la fusión del paladar secundario de ratón mediante microscopía confocal. Este protocolo puede usarse en combinación con una variedad de líneas de ratón fluorescentes de reportero, y con inhibidores de vía para una visión mecánica. Este protocolo puede ser adaptado para imágenes en vivo en otros sistemas de desarrollo.

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

live-imaging-of-mouse-secondary-palate-fusion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K vistas.  University of California San Francisco.  Aquí, presentamos un protocolo para la imagen en vivo de la fusión del paladar secundario de ratón mediante microscopía confocal. Este protocolo puede usarse en combinación con una variedad de líneas de ratón fluorescentes de reportero, y con inhibidores de vía para una visión mecánica. Este protocolo puede ser adaptado para imágenes en vivo en otros sistemas de desarrollo. 

Video: Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Investigación

Biología del Desarrollo

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Diferenciación in vitro de las fibras maduras de imágenes en vivo

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivir Imagen confocal de desarrollo de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagen en vivo y análisis de contracciones musculares en Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Fundición vascular de pulmones de ratón postnatales tempranos y adultos para imágenes micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...