Este protocolo proporciona control espacial y temporal para el ensamblaje de nanopartículas activas SERS en ausencia de agentes de agregación para lograr una detección sensible de analitos objetivo. La principal ventaja de nuestro método es que no se utilizan agentes de agregación para generar el conjunto de nanopartículas activas SERS, por lo que se utiliza adecuado para analizar biomoléculas sensibles en condiciones fisiológicas. Es una plataforma prometedora para detectar moléculas de analito, como biomarcadores de enfermedades, en soluciones y en condiciones fisiológicas en un sistema microfluídico.
Al usar este método por primera vez, un investigador puede necesitar ajustar la potencia del láser de captura, el tiempo de irradiación y la concentración de nanopartículas de plata para lograr el mejor rendimiento. Para comenzar, dirija un rayo láser de 532 nanómetros al puerto flexible del microscopio de pinza óptica. Alinee el rayo láser de 532 nanómetros en las vías estéreo de doble capa del microscopio de pinza óptica con un espejo dicroico de paso largo de 750 nanómetros para combinarlos con los rayos láser de captura originales para enfocar la cámara de muestra.
Recoja la luz retrodispersada de la cámara de muestras utilizando un espejo dicroico de paso largo de 750 nanómetros y rediríjala a un espectrómetro que contenga una cámara de dispositivo de carga acoplada refrigerada por nitrógeno líquido. Coloque un filtro de muesca de 532 nanómetros delante de la ranura de entrada del espectrómetro antes de la adquisición espectral. Limpie el portaobjetos de vidrio y cubra el deslizamiento con agua y etanol.
Fije la cinta adhesiva al portaobjetos de vidrio para crear una cámara. Agregue unas gotas de la solución DSNB de nanopartículas de plata en el marco. Coloque el cubreobjetos en la cinta del marco y séllelo.
Agregue nitrógeno líquido al recipiente de la cámara del dispositivo de carga acoplada refrigerada por nitrógeno líquido hasta que la temperatura alcance menos 120 grados centígrados. Bloquee la trayectoria del haz de la sonda Raman con una pantalla de seguridad láser magnética y, a continuación, encienda el láser de fuente de excitación Raman de 532 nan. Fije la cámara de muestra con la solución DSNB de nanopartículas de plata en el soporte de la cámara.
Agregue agua al objetivo sumergido en agua, luego coloque el soporte de la cámara inmediatamente en el microescenario sobre el objetivo. Coloque el aceite de inmersión sobre el deslizamiento de la cubierta y coloque el condensador sumergido en aceite para visualizar las partículas en la cámara del microscopio. Ajuste la posición Z del objetivo girando la perilla del microscopio hasta que el haz de sonda Raman de 532 nanómetros se enfoque en la superficie inferior de vidrio de la cámara, mostrando una mancha blanca en la cámara del microscopio.
Ajuste las posiciones X e Y de la microetapa para mover la cámara y colocar la región central de la cámara en el punto blanco. Abra el software de control de pinza óptica y use el control de joystick equipado para mover el láser de captura de 1.064 nanómetros para que se superponga con el punto blanco. A continuación, ajuste la perilla del microscopio para mover la posición Z del objetivo hacia arriba.
Encienda el láser de captura de 1.064 nanómetros para atraer nanopartículas de plata en la cámara de muestras y crear un conjunto plasmónico de nanopartículas de plata. Baje el rayo láser de captura para evitar el sobrecalentamiento o la formación de burbujas cuando sea necesario. Ajuste la posición de la microetapa de la muestra para colocar la mancha oscura del conjunto de nanopartículas de plata plasmónica bajo el foco del haz de sonda Raman de 532 nanómetros para mediciones espectroscópicas.
Coloque los filtros de densidad neutra frente a la salida láser Raman de 532 nanómetros para ajustar la potencia a 10 megavatios. Introduzca el tiempo de adquisición en el panel de configuración del software del espectro y haga clic en el botón Adquirir para iniciar la adquisición espectral. Sin el láser de captura, las nanopartículas de plata dispersas en la cámara de muestra generaron un espectro negro.
Aumentar la potencia y extender el tiempo de irradiación del láser de captura podría atraer más nanopartículas de plata y generar una mancha oscura. Dado que las nanopartículas de plata dispersas estaban bajo movimiento browniano, las uniones entre partículas eran grandes e inestables. Las intensidades generales de DSNB en el conjunto de nanopartículas de plata plasmónicas fueron más altas que las de la nanopartícula de plata dispersa.
Teniendo en cuenta la intensidad del pico característico a 1.444 centímetros inverso, el conjunto plasmónico de nanopartículas de plata puede proporcionar aproximadamente una mejora de 50 veces de la señal de espectroscopia Raman mejorada en superficie de DSNB en comparación con la de las nanopartículas de plata dispersas. Las intensidades de los picos característicos de DSNB en 1, 152, 1, 444 y 1, 579 centímetros inversas a través de estos 20 espectros Raman mejorados en superficie se trazaron como histogramas con desviaciones estándar relativas de 6.88, 6.59 y 5.48% respectivamente. Lo más importante en este procedimiento es localizar la posición del láser de sonda Raman de 532 nanómetros y superponerla con el láser de captura de 1.064 nanómetros.
Esta técnica allana el camino para que los investigadores detecten moléculas de analito con control espacial y temporal en condiciones fisiológicas para futuros análisis in vivo.
