Este protocolo permite purificar complejos de septinas de alta calidad, y esto es esencial para estudiar los muchos roles de las septinas en la célula. La principal ventaja de este enfoque es la síntesis de un procedimiento simple para purificar septina de alta calidad utilizando plásmidos Addgene. Las septinas son difíciles de estudiar en las células debido a sus muchas interacciones.
La reconstitución de azufre nos ayuda a desentrañar esta complejidad estudiándolas en un sistema simple. Recomendamos hacer la purificación en un solo día para evitar la degradación. En nuestra experiencia, esto aumentará la vida útil y la calidad de la proteína.
Para comenzar, cultive el cultivo bacteriano transformado a 37 grados centígrados en una incubadora agitadora hasta que la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nanómetros alcance dos o tres para septinas no marcadas, o 0.6 a 0.8 para septinas marcadas con msfGFP o mEGFP. Después de la incubación, inducir la expresión de proteínas agregando IPTG a una concentración final de 0.5 milimolar e incubar las células que expresan heterooligómeros de septina no marcados a 37 grados Celsius durante tres horas, o las células que expresan heterooligómeros marcados con msfGFP a 17 grados Celsius durante la noche. Luego pellet las células a 4, 000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante y disuelva el pellet en 100 mililitros de tampón de lisis para lisar las células. A continuación, use un sonicador de punta a 30% de amplitud para sonicar la celda. Aclarar el lisado celular centrifugando a 20, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y guardar el sobrenadante.
Opcionalmente, tome una muestra para desnaturalizar la electroforesis como se describe en el manuscrito. Para la cromatografía de afinidad de septinas marcadas con His, equilibre una columna de cromatografía de alta resolución de níquel sefarosa preempaquetada con todos los tampones necesarios. Cargue el sobrenadante clarificado hasta la columna e inicie el sistema de cromatografía.
Luego eluya los complejos de septina con un tampón de elución 50% HisTrap a un caudal de un mililitro por minuto. Para obtener una concentración de imidazol de 250 milimolar, recoja fracciones de 0,5 mililitros. Ahora monitoree la absorbancia óptica del eluido a 280 nanómetros con un sistema rápido de cromatografía líquida de proteínas y elija las fracciones que contienen complejos de septina.
Para la cromatografía de afinidad de proteínas marcadas con Strep-II, equilibre una columna de cromatografía de alta resolución de StrepTactin sepharose preempaquetada con tampón septina. Cargue las fracciones que contienen septina recuperadas de la columna de níquel a una velocidad de un mililitro por minuto e inicie el sistema de cromatografía. Luego lave la proteína unida y eluya los complejos de septina con tampón de elución 100% StrepTrap a una velocidad de flujo de un mililitro por minuto.
Para producir una concentración de 2.5 milimolar destiobiotina, recolecte fracciones de 0.5 mililitros. Elija las fracciones que contienen complejos de septina como lo indica la absorbancia óptica del eluido a 280 nanómetros monitoreados en línea con un sistema rápido de cromatografía líquida de proteínas. Después de eliminar la destiobiotina por alícuota de diálisis, coloque los complejos de proteínas en el tamaño de alícuota deseado, congele rápidamente la alícuota y guárdela a menos 80 grados centígrados.
Para la microscopía de dispersión interferométrica, lave los portaobjetos de vidrio número 1.5 sonicándolos en un limpiador ultrasónico durante cinco minutos cada uno en agua, isopropanol y nuevamente en agua desionizada. Seque dos portaobjetos de vidrio con una suave corriente de gas nitrógeno. Luego coloque una gota de siete microlitros de solución de poli-L-lisina al 0,01% en el centro de uno de los portaobjetos y coloque el centro del otro portaobjetos encima de la gota de poli-L-lisina, orientando los dos portaobjetos ortogonalmente para una fácil separación.
Después de incubar durante 30 segundos, lave el portaobjetos sumergiéndolo en un vaso de precipitados que contenga agua desionizada una vez y aplicando directamente un chorro de agua dos veces. Séquelos con un flujo de gas nitrógeno y estos portaobjetos se pueden almacenar durante aproximadamente seis semanas a temperatura ambiente en condiciones secas. Antes del experimento, corte una pieza de juntas de dos en dos, tres por dos o tres por tres y péguelas en la parte tratada con poli-L-lisina de un portaobjetos de vidrio, evitando que la diapositiva de vidrio y las juntas entren en contacto con cualquier superficie sucia colocando la diapositiva sobre un pañuelo limpiaparabrisas de servicio ligero.
Ahora presione las juntas con una punta de pipeta para pegarlas con el plástico protector presente en las juntas. A continuación, caliente el tampón de septina a temperatura ambiente. Descongele las proteínas en la mano y manténgalas en hielo después.
Luego coloque la diapositiva con juntas en el sistema de fotometría de masa comercial que contiene 19 microlitros de tampón de septina y enfoque el microscopio usando la opción de enfoque automático. Vuelva a enfocar con la nueva configuración, utilizando la opción de enfoque automático. Para crear una carpeta de proyecto, haga clic en Archivo seguido de Nuevo proyecto y, para cargar una carpeta de proyecto para almacenar datos, haga clic en Archivo seguido de Cargar proyecto.
Luego pipete un microlitro de muestra a 19 microlitros de gota tampón del tabique. Mezcle, y mientras mezcla, evite tocar cualquier cosa para evitar el movimiento de la diapositiva. Luego grabe un video de 6, 000 cuadros haciendo clic en Grabar.
Analice los videos utilizando el software del fabricante para obtener la distribución de masa de proteínas. Si los picos de diferentes tamaños de heterooligómeros de septina se superponen demasiado o se detectan demasiados eventos, disminuya la concentración final de septina y mida nuevamente. Y cuando no se midan suficientes recuentos de moléculas individuales, aumente la concentración de septina y mida nuevamente.
Para el análisis de septina, prepare el 5X darkSPB y una mezcla de septina que consista en septina oscura al 100% a una concentración seis veces mayor que la concentración final deseada en tampón de septina y un ditiothreitol milimolar. Luego polimerizar la septina mezclando agua, 20% 5X darkSPB y 16.67% mezcla de septina, en este orden específico, e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agregue de tres a cinco microlitros de muestra a una rejilla de microscopía electrónica descargada incandescente e incube durante un minuto.
Ahora, lave la rejilla dos veces agregando una gota de tampón SPB oscuro y absorba el líquido con un papel de filtro. Lavar una vez con agua e incubar durante 30 segundos con acetato de uranilo al 2%. A continuación, seque la mancha y seque al aire la muestra durante unos minutos.
Luego obtenga una imagen de los haces de septina a 120 kilovoltios y aumentos entre 5, 000X y 60, 000X con un desenfoque de uno a dos micrómetros. El cromatograma HisTrap y StrepTrap mostraron que la fracción agrupada fue desde el inicio del pico de elución hasta que la absorbancia se estabilizó en alrededor de 250 mililitros y 50 mililitros respectivamente. Las bandas de septina mostraron intensidades similares en la electroforesis en gel desnaturalizante, lo que sugiere que las septinas están intactas.
En la electroforesis nativa, se observó la banda mayor correspondiente a los heterooligómeros intactos y una banda menor correspondiente a los trimores o tetrámeros. El peso molecular aparente de los complejos marcados con msfGFP es indistinguible del de los complejos no marcados. La fotometría de masas detectó octámeros y hexámeros intactos de septinas.
Un pico adicional a 241 kilodaltons indicó la presencia de dos proteínas de maní, DSep1 y mEGFP-DSep2. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de complejos de septina mostraron varillas de hexámeros y octámeros. Las etiquetas msfGFP son visibles como densidades difusas en los dos extremos en septina 2 msfGFP septina humana octamers_9i1.
Se pueden observar pequeños grupos de proteínas en el campo TIRF poco profundo. La microscopía confocal reveló grandes grupos de estructuras filamentosas flotantes. La microscopía electrónica de transmisión mostró haces de septina pequeños y grandes correspondientes a los grupos observados por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total y microscopía confocal.
Recomendamos trabajar sobre hielo en todo momento durante las purificaciones y añadir reactivos frescos que especifiquemos en el protocolo. Estamos interesados en las interacciones de las septinas en el contexto de la citocinesis. Reconstituimos septina junto con membranas modernas de actina y microtúbulos para estudiarlos con microscopía y varios ensayos biofísicos.
Utilizamos las septinas purificadas para estudiar cómo interactúan las septinas con filamentos de actina, microtúbulos y lípidos. Y también usamos las septinas purificadas para construir células sintéticas donde las septinas facilitan la división celular.
