Este protocolo torna possível purificar complexos de septina de alta qualidade, e isso é essencial para estudar os muitos papéis das septinas na célula. A principal vantagem desta abordagem é a síntese de um procedimento simples para purificar a septina de alta qualidade usando plasmídeos Addgene. As septinas são difíceis de estudar nas células devido às suas muitas interações.
A reconstituição do enxofre nos ajuda a desembaraçar essa complexidade, estudando-os em um sistema simples. Recomendamos fazer a purificação em um único dia para evitar a degradação. Em nossa experiência, isso aumentará a vida útil e a qualidade da proteína.
Para começar, cultive a cultura bacteriana transformada a 37 graus Celsius em uma incubadora agitadora até que a densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nanômetros atinja dois a três para septinas não marcadas, ou 0,6 a 0,8 para septinas marcadas com msfGFP ou mEGFP. Após a incubação, induzir a expressão proteica adicionando IPTG a uma concentração final de 0,5 milimolar e incubar as células que expressam hetero-oligômeros de septina não marcados a 37 graus Celsius por três horas, ou as células que expressam msfGFP marcadas hetero-oligômeros a 17 graus Celsius durante a noite. Em seguida, pelote as células a 4.000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante e dissolva o pellet em 100 mililitros de tampão de lise para lisar as células. Em seguida, use um sonicator de ponta a 30% de amplitude para sonicar a célula. Esclareça o lisado celular centrifugando a 20.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius e salve o sobrenadante.
Opcionalmente, pegue uma amostra para eletroforese desnaturante, conforme descrito no manuscrito. Para cromatografia de afinidade de septinas marcadas com His, equilibre uma coluna de cromatografia de alta eficiência de sefarose de níquel pré-embalada com todos os buffers necessários. Carregar o sobrenadante clarificado até à coluna e iniciar o sistema de cromatografia.
Em seguida, elimine os complexos de septina com tampão de eluição 50%HisTrap a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Para produzir uma concentração de imidazol de 250 milimolares, colete frações de 0,5 mililitro. Agora monitore a absorvância óptica do eluato a 280 nanômetros com um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida e escolha as frações contendo complexos de septina.
Para cromatografia de afinidade de proteínas marcadas com Strep-II, equilibre uma coluna de cromatografia de alta eficiência StrepTactin sepharose pré-embalada com tampão de septina. Carregar as fracções contendo septina recuperadas da coluna de níquel a uma velocidade de um mililitro por minuto e iniciar o sistema de cromatografia. Em seguida, lave a proteína ligada e elimine os complexos de septina com 100% de tampão de eluição StrepTrap a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto.
Para produzir uma concentração de 2,5 milimolares de destiobiotina, colete frações de 0,5 mililitros. Escolha as frações contendo complexos de septina, conforme indicado pela absorvância óptica do eluato a 280 nanômetros monitorados on-line com um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida. Depois de remover a destiobiotina por alíquota de diálise, coloque os complexos proteicos no tamanho de alíquota desejado, congele a alíquota e armazene-a a menos 80 graus Celsius.
Para a microscopia de espalhamento interferométrico, lave as lâminas de vidro número 1.5 sonicando-as em um limpador ultrassônico por cinco minutos cada em água, isopropanol e novamente em água deionizada. Seque duas lâminas de vidro com um fluxo suave de gás nitrogênio. Em seguida, coloque uma gota de sete microlitros de solução de poli-L-lisina a 0,01% no centro de uma das lâminas e coloque o centro da outra lâmina em cima da gota de poli-L-lisina, orientando as duas lâminas ortogonalmente para facilitar a separação.
Depois de incubar por 30 segundos, lave a lâmina imergindo em um copo contendo água deionizada uma vez e aplicando diretamente um fluxo de água duas vezes. Seque-os com um fluxo de gás nitrogênio e essas lâminas podem ser armazenadas por cerca de seis semanas à temperatura ambiente em condições secas. Antes do experimento, corte um pedaço de duas por duas, três por duas ou três por três juntas e cole-as na parte tratada com poli-L-lisina de uma lâmina de vidro, evitando que a lâmina de vidro e as juntas entrem em contato com qualquer superfície suja, colocando a lâmina em um tecido de limpador leve.
Agora pressione as juntas com uma ponta de pipeta para colá-las com o plástico protetor presente nas juntas. Em seguida, aqueça o tampão de septina à temperatura ambiente. Descongele as proteínas na mão e mantenha-as no gelo depois.
Em seguida, coloque a lâmina com juntas no sistema comercial de fotometria de massa contendo 19 microlitros de tampão de septina e foque o microscópio usando a opção de foco automático. Refoque com as novas configurações, usando a opção de foco automático. Para criar uma pasta de projeto, clique em Arquivo seguido de Novo Projeto e, para carregar uma pasta de projeto para armazenar dados, clique em Arquivo seguido de Carregar Projeto.
Em seguida, pipete um microlitro de amostra para 19 microlitros de gota tampão de septo. Misture e, durante a mistura, evite tocar em qualquer coisa para evitar o movimento do slide. Em seguida, grave um vídeo de 6.000 quadros clicando em Gravar.
Analise os vídeos usando o software do fabricante para obter a distribuição de massa de proteínas. Se os picos de diferentes tamanhos de hetero-oligômeros de septina se sobreporem demais ou muitos eventos forem detectados, diminua a concentração final de septina e meça novamente. E quando contagens suficientes de moléculas individuais não forem medidas, aumente a concentração de septina e meça novamente.
Para a análise da septina, prepare o 5X darkSPB e uma mistura de septina consistindo de 100% de septina escura a uma concentração seis vezes maior do que a concentração final desejada no tampão de septina e um Dithiothreitol milimolar. Em seguida, polimerizar a septina misturando água, 20% 5X darkSPB e 16,67% septina mistura, nesta ordem específica, e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Adicione de três a cinco microlitros de amostra a uma grade de microscopia eletrônica descarregada por brilho e incube por um minuto.
Agora, lave a grade duas vezes adicionando uma gota de tampão darkSPB e absorva o líquido com um papel de filtro. Lave uma vez com água e incube por 30 segundos com acetato de uranila a 2%. Em seguida, limpe a mancha e seque a amostra ao ar por alguns minutos.
Em seguida, imagine os feixes de septina a 120 quilovolts e ampliações entre 5, 000X e 60, 000X com um desfocagem de um a dois micrômetros. O cromatograma HisTrap e StrepTrap mostrou que a fração agrupada passou desde o início do pico de eluição até a absorbância estabilizada em cerca de 250 mililitros e 50 mililitros, respectivamente. As bandas de septina apresentaram intensidades semelhantes na eletroforese em gel desnaturante, sugerindo que as septinas estão intactas.
Na eletroforese nativa, observou-se a banda maior correspondente aos heterooligômeros intactos e uma banda menor correspondente aos trimores ou tetrâmeros. O peso molecular aparente dos complexos marcados com msfGFP é indistinguível do dos complexos não marcados. A fotometria de massa detectou otâmeros e hexâmeros intactos de septinas.
Um pico adicional de 241 quilodaltons indicou a presença de duas proteínas de amendoim, DSep1 e mEGFP-DSep2. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de complexos de septina mostraram hastes de hexâmeros e octameros. As tags msfGFP são visíveis como densidades difusas, nas duas extremidades em septina 2 msfGFP octamers_9i1 de septina humana.
Pequenos aglomerados de proteínas podem ser observados no campo TIRF raso. A microscopia confocal revelou grandes aglomerados de estruturas filamentosas flutuantes. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou pequenos e grandes feixes de septina correspondentes aos aglomerados observados pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total e microscopia confocal.
Recomendamos trabalhar no gelo em todos os momentos durante as purificações e adicionar reagentes frescos que especificamos no protocolo. Estamos interessados em interações de septinas no contexto da citocinese. Reconstituímos a septina juntamente com as membranas modernas actina e microtúbulos para estudá-los com microscopia e vários ensaios biofísicos.
Usamos as septinas purificadas para estudar como as septinas interagem com filamentos de actina, microtúbulos e lipídios. E também usamos as septinas purificadas para construir células sintéticas, onde as septinas facilitam a divisão celular.
