Bu protokol, yüksek kaliteli septin komplekslerini saflaştırmayı mümkün kılar ve bu, septinlerin hücredeki birçok rolünü incelemek için gereklidir. Bu yaklaşımın temel avantajı, Addgene plazmidleri kullanarak yüksek kaliteli septini saflaştırmak için basit bir prosedürün sentezlenmesidir. Septinlerin birçok etkileşimi nedeniyle hücrelerde incelenmesi zordur.
Kükürt sulandırması, bu karmaşıklığı basit bir sistemde inceleyerek çözmemize yardımcı olur. Bozulmayı önlemek için tek bir günde saflaştırma yapmanızı öneririz. Deneyimlerimize göre, bu proteinin ömrünü ve kalitesini artıracaktır.
Başlamak için, dönüştürülmüş bakteri kültürünü bir çalkalayıcı inkübatörde 37 santigrat derecede büyütün, 600 nanometre dalga boyundaki optik yoğunluk etiketlenmemiş septinler için iki ila üçe veya msfGFP veya mEGFP etiketli septinler için 0.6 ila 0.8'e ulaşana kadar. Kuluçkadan sonra, IPTG'yi 0.5 milimolar nihai konsantrasyona ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin ve etiketlenmemiş septin hetero-oligomerlerini 37 santigrat derecede eksprese eden hücreleri üç saat boyunca inkübe edin veya msfGFP eksprese eden hücreler gece boyunca 17 santigrat derecede hetero-oligomerleri inkübe edin. Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 4.000 kez G'de toplayın.
Süpernatantı atın ve hücreleri lize etmek için peleti 100 mililitre lizis tamponunda çözün. Ardından, hücreyi sonikleştirmek için% 30 genlikte bir uç sonikatör kullanın. Dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüj yaparak hücre lizatını netleştirin ve süpernatanı kurtarın.
İsteğe bağlı olarak, makalede açıklandığı gibi elektroforezi denatüre etmek için bir örnek alın. His etiketli septinlerin afinite kromatografisi için, önceden paketlenmiş bir nikel sefarozun yüksek performanslı kromatografi kolonunu gerekli tüm tamponlarla dengeleyin. Arıtılmış süpernatantı kolona kadar yükleyin ve kromatografi sistemini başlatın.
Daha sonra septin komplekslerini% 50 HisTrap elüsyon tamponu ile dakikada bir mililitre akış hızında süzün. 250 milimolarlık bir imidazol konsantrasyonu elde etmek için, 0.5 mililitre fraksiyonları toplayın. Şimdi hızlı bir protein sıvı kromatografi sistemi ile 280 nanometrede elüatın optik emilimini izleyin ve septin kompleksleri içeren fraksiyonları seçin.
Strep-II etiketli proteinlerin afinite kromatografisi için, önceden paketlenmiş bir StrepTactin sefarozu yüksek performanslı kromatografi kolonunu septin tamponu ile dengeler. Nikel kolonundan geri kazanılan septin içeren fraksiyonları dakikada bir mililitre oranında yükleyin ve kromatografi sistemini başlatın. Daha sonra bağlı proteini yıkayın ve septin komplekslerini% 100 StrepTrap elüsyon tamponu ile dakikada bir mililitre akış hızında süzün.
2.5 milimolar desthiobiotin konsantrasyonu elde etmek için, 0.5 mililitre fraksiyonları toplayın. Hızlı bir protein sıvı kromatografi sistemi ile çevrimiçi olarak izlenen 280 nanometrede elüatın optik emilimi ile belirtildiği gibi septin kompleksleri içeren fraksiyonları seçin. Deshiobiotin'i diyaliz aliquot ile çıkardıktan sonra, protein kompleksleri istenen aliquot boyutuna getirin, aliquot'u dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
İnterferometrik saçılma mikroskobu için, cam slaytları 1.5 numaralı slaytları, her biri beş dakika boyunca suda, izopropanolde ve tekrar deiyonize suda ultrasonik bir temizleyicide sonikleştirerek yıkayın. İki cam kaydırağı yumuşak bir azot gazı akışıyla kurulayın. Ardından, slaytlardan birinin ortasına yedi mikrolitrelik bir Poli-L-Lizin çözeltisi damlası yerleştirin ve diğer slaytın merkezini Poli-L-Lizin damlasının üzerine yerleştirin ve iki slaytı kolay ayırma için ortogonal olarak yönlendirin.
30 saniye boyunca inkübe ettikten sonra, bir kez deiyonize su içeren bir beherin içine daldırarak ve doğrudan iki kez su akışı uygulayarak slaytı yıkayın. Azot gazı akışıyla kurutun ve bu slaytlar kuru koşullarda oda sıcaklığında yaklaşık altı hafta saklanabilir. Deneyden önce, ikişer ikişer, üçe iki veya üçe üç contadan oluşan bir parçayı kesin ve bunları bir cam slaytın Poli-L-Lizin ile muamele edilmiş kısmına yapıştırın, cam slaytı ve contaları hafif hizmet tipi bir silecek dokusuna yerleştirerek herhangi bir kirli yüzeye temas etmesini önleyin.
Şimdi contaları bir pipet ucuyla bastırarak contaların üzerinde bulunan koruyucu plastikle yapıştırın. Daha sonra, septin tamponunu oda sıcaklığına ısıtın. Eldeki proteinleri çözün ve daha sonra buz üzerinde tutun.
Ardından, contalı slaytı 19 mikrolitre septin tamponu içeren ticari kütle fotometri sistemine yerleştirin ve otomatik odaklama seçeneğini kullanarak mikroskobu odaklayın. Otomatik netleme seçeneğini kullanarak yeni ayarlarla yeniden netleme. Bir proje klasörü oluşturmak için, Dosya'nın ardından Yeni Proje'yi tıklatın ve verileri depolamak üzere bir proje klasörü yüklemek için Dosya'yı ve ardından Projeyi Yükle'yi tıklatın.
Daha sonra pipetten bir mikrolitre numune 19 mikrolitre septum tamponuna damlatılır. Karıştırın ve karıştırırken, slaytın hareketini önlemek için herhangi bir şeye dokunmaktan kaçının. Ardından, Kaydet'e tıklayarak 6.000 karelik bir video kaydedin.
Protein kütle dağılımını elde etmek için üreticinin yazılımını kullanarak videoları analiz edin. Farklı septin hetero-oligomer boyutlarının zirveleri çok fazla örtüşürse veya çok fazla olay tespit edilirse, son septin konsantrasyonunu azaltır ve tekrar ölçer. Ve yeterli sayıda tek molekül ölçülmediğinde, septin konsantrasyonunu artırın ve tekrar ölçün.
Septin analizi için, 5X darkSPB'yi ve septin tamponunda istenen son konsantrasyondan altı kat daha yüksek konsantrasyonda% 100 koyu septinden oluşan bir septin karışımı ve bir milimolar Dithiothreitol hazırlayın. Daha sonra bu özel sırayla su,% 205X darkSPB ve% 16.67 septin karışımı karıştırarak septini polimerize edin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Parıltılı bir elektron mikroskobu ızgarasına üç ila beş mikrolitre numune ekleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin.
Şimdi, bir damla darkSPB tamponu ekleyerek ızgarayı iki kez yıkayın ve sıvıyı bir filtre kağıdıyla emer. Bir kez suyla yıkayın ve% 2 uranil asetat ile 30 saniye inkübe edin. Daha sonra, lekeyi lekeleyin ve numuneyi birkaç dakika boyunca hava ile kurutun.
Daha sonra septin demetlerini 120 kilovoltta ve 5.000X ile 60.000X arasında büyütmeleri bir ila iki mikrometre odak ile görüntüleyin. HisTrap ve StrepTrap kromatogramı, havuzlanmış fraksiyonun elüsyon zirvesinin başlangıcından absorbansın sırasıyla yaklaşık 250 mililitre ve 50 mililitrede stabilize olana kadar gittiğini gösterdi. Septin bantları, denatüre jel elektroforezinde benzer yoğunluklar gösterdi ve bu da septinlerin sağlam olduğunu düşündürdü.
Doğal elektroforezde, bozulmamış hetero-oligomerlere karşılık gelen ana bant ve tribrörlere veya tetramerlere karşılık gelen küçük bir bant gözlenmiştir. msfGFP etiketli komplekslerin görünür moleküler ağırlığı, etiketlenmemiş komplekslerinkinden ayırt edilemez. Kütle fotometrisinde septinlerin sağlam oktamerleri ve heksamerleri saptandı.
241 kilodaltondaki ek bir zirve, iki fıstık proteininin, DSep1 ve mEGFP-DSep2'nin varlığını gösterdi. Septin komplekslerinin transmisyon elektron mikroskobu görüntülerinde heksamer ve oktamer çubukları görüldü. msfGFP etiketleri, septin 2 msfGFP insan septin octamers_9i1 iki ucunda bulanık yoğunluklar olarak görülebilir.
Sığ TIRF alanında küçük protein kümeleri gözlenebilir. Konfokal mikroskopi, yüzen filamentli yapıların büyük kümelerini ortaya çıkardı. İletim elektron mikroskobu, toplam iç yansıma floresan mikroskobu ve konfokal mikroskopi ile gözlenen kümelere karşılık gelen küçük ve büyük septin demetleri gösterdi.
Saflaştırmalar sırasında her zaman buz üzerinde çalışmanızı ve protokolde belirttiğimiz taze reaktifleri eklemenizi öneririz. Sitokinezi bağlamında septinlerin etkileşimleriyle ilgileniyoruz. Septini, mikroskopi ve çeşitli biyofiziksel tahlillerle incelemek için modern membranlar aktin ve mikrotübüllerle birlikte yeniden yapılandırdık.
Saflaştırılmış septinleri, septinlerin aktin filamentleri, mikrotübüller ve lipitlerle nasıl etkileşime girdiğini incelemek için kullanıyoruz. Ayrıca saflaştırılmış septinleri, septinlerin hücre bölünmesini kolaylaştırdığı sentetik hücreler oluşturmak için kullanıyoruz.
