Fondos internos institucionales y las Ciencias Biológicas Programa de Becas de la Universidad de Michigan apoya este trabajo.

Gusano de preparación <ol><li> Transferencia L4 gusanos larvas en placas apropiadas de 18 24 horas antes de la imagen 22. Esto le asegura ovígeras adultos de una amplia oferta de embriones tempranos. </li><li> Prepare los tubos de vaselina y agarosa. Preparamos varios tubos Falcon de 15 ml por la fusión de vaselina en un recipiente en el microondas y la distribución en alícuotas 4-5 ml por tubo. Del mismo modo derretir 2-3% (w / v) de agarosa en buffer (buffer M9 o huevo) y alícuota de 4-5 ml en tubos Falcon. Tenga cuidado de no hervir en exceso con el fin de minimizar la evaporación. En el día de la imagen, derretir un tubo de vaselina en un 65-70 º C del bloque de calor y fundir un tubo de agarosa en el horno de microondas, una vez más tener cuidado para minimizar hirviendo. Guarde los tubos en el bloque de calor para mantener la vaselina y la agarosa en estado fundido. </li><li> Hacer agarosa almohadilla. Posición de una diapositiva nueva entre dos microscopía diapositivas guía, que se desliza cubiertos por una capa de cinta común de laboratorio adherido a la parte superior e inferior de cada diapositiva de guía. Utilice una pipeta Pasteur con el extremo roto de poner 2-3 gotas de agarosa derretida en la nueva diapositiva. Cubrir con una perpendicular 2 ª diapositiva a la diapositiva original, por lo que lo cubre y ayuda a difundir la agarosa para crear una plataforma cuadrada delgada. La diapositiva 2 º debe descansar sobre la cinta en las diapositivas guía. La concentración de agarosa puede ser mayor a un 5% más gruesas almohadillas. </li><li> El uso de un microscopio de disección y un alambre de platino &quot;pick&quot;, la transferencia de dos gusanos adultos a una caída del 9-12μL de tampón M9 o el huevo en un 18 mm x 18 mm cubreobjetos. </li><li> Cortar los gusanos abrir con una aguja (que utilizamos 27G1 / 2 agujas) o un bisturí para liberar los embriones. Tratar de cortar en el medio de la lombriz. </li><li> Menor de agarosa almohadilla (con el lado de agar hacia abajo) en el portaobjetos 18x18 mm que contiene los embriones. Agar corte se extiende desde el borde de la hoja de la cubierta con una hoja de afeitar. </li><li> Sello cubreobjetos usando una brocha o un palo de madera delgado para aplicar la vaselina fundida para los cuatro bordes del cubreobjetos. </li></ol> Alternativa a la monta agar cuelgan gotas de 23 años si los embriones son sensibles a la presión (es decir, si la cáscara del huevo no se forma correctamente). Imagen también se puede realizar en el útero para seguir la fertilización o principios de los acontecimientos, tales como meiosis. Gusanos debe ser anestesiados con levamisol 24. Con el fin de aumentar el número de embriones a partir de una determinada fase de desarrollo, varios gusanos pueden ser diseccionados a la vez y los embriones colocados juntos suavemente con una punta fina pipeta o un cepillo de pestañas o pipetear con la boca. 4D Nomarski DIC (contraste diferencial de interferencia) Películas <ol start="8"><li> A su vez en el microscopio Olympus BX61. Debido a que la cámara es sensible a las ondas electromagnéticas emitidas por otros dispositivos que se convirtió en el último, el bulbo de mercurio (si es necesario para las buenas prácticas agrarias o de fluorescencia) en primer lugar. Inicio Micro-Manager, una vez que todo está en. Elija el fichero de configuración apropiado para imágenes DIC o fluorescentes. La principal diferencia es que el archivo DIC no incluye el control de disparo fluorescentes. Cada archivo también selecciona el cubo correspondiente filtro y ajuste de la ganancia de la cámara. </li><li> Encontrar embriones en el microscopio con objetivo de 10x. Mira cerca de los cuerpos de gusanos para grupos de embriones jóvenes con el fin de obtener varios embriones en el campo de la imagen. Evite los embriones en el interior del gusano de las mejores imágenes. </li><li> Con el interruptor de software a un mayor aumento (40x a 100x) y la resolución (NA 0,9 a 1,4) para obtener imágenes de objetivo. </li><li> Ajuste Nomarski óptica DIC (Los siguientes sitios web contienen una explicación útil de la óptica DIC y la terminología; <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha"><li> En nuestro Olympus BX61 los componentes importantes son los siguientes: <ol><li> Polarizador - deslizante debajo del condensador </li><li> Condensador Wollaston Prisma - torreta en el condensador, justo debajo del escenario. </li><li> Objetivo del prisma de Wollaston - barra deslizante debajo de los cubos de filtro </li><li> 2 º polarizador (analizador) - cubo de filtro en la posición de DIC </li></ol></li><li> Interruptor de filtro Cubo de DIC a la posición del analizador (2 polarizador º) en la trayectoria de la luz (software debe hacer esto en el arranque). </li><li> Asegúrese de que los dos polarizadores están correctamente alineados (cruzado). Cuando los dos prismas de Wollaston están fuera de la trayectoria de la luz del campo de visión debe ser oscuro. Si es necesario, girar el polarizador por debajo del condensador hasta que esto es correcto. </li><li> Inserte el objetivo (superior) del prisma de Wollaston en la trayectoria de la luz. </li><li> Girar la torreta en el condensador para seleccionar el prisma de Wollaston que coincide con el objetivo de que esté utilizando. </li><li> Ajuste deslizante debajo de esta torreta para que coincida con AN de la lente. </li><li> Enfoque del condensador para una óptima iluminación Koehler. </li><li> Ajuste la parte superior del Pri Wollastonsm para conseguir un contraste óptimo girando el mando en el control deslizante. </li><li> Otros ajustes controlados por el inicio de software incluyen el aumento de la cámara (a 0) y cambiar al guardar archivos como no de 8-bit 16-bit TIFF. </li></ol></li><li> Ajuste el nivel de luz para dar buena imagen. (Por lo general utilizan 4.7 voltios) (controlado por software). Nosotros preferimos para iluminar la muestra para que los más brillantes píxeles están justo debajo de los niveles de saturación. Un buen resultado de la óptica DIC en una imagen con un aspecto de 3 dimensiones, donde los gránulos de yema en el embrión se destacan claramente. Por otra parte esto puede ser descrito como si la luz que ilumina la muestra parece brillar desde un ángulo tal que una parte de la muestra (o las características de la muestra) es muy iluminado y el lado opuesto se encuentra en las sombras y aparece más oscura. </li><li> Seleccione Región de interés (ROI) para incluir a los embriones que desee a la imagen, haga clic en el botón Set retorno de la inversión para reducir la ventana. </li><li> Abra la ventana de adquisición multi-dimensional. Seleccione Z-pilas (rodajas) y puntos de tiempo. </li><li> Utilice el mando microscopio enfoque para encontrar la parte inferior del embrión (último plano focal con algunos gránulos de yema de enfoque). Haga clic en Seleccionar en la parte inferior. Repita el proceso para identificar y establecer la parte superior del embrión. Por lo general, utilizan un tamaño de micrones paso y terminar con ~ 20 planos focales. Por lo general, recogen múltiples planos focales en cada momento, porque los embriones y las células son relativamente gruesos. Además, especialmente cuando las células comienzan a dividirse en diferentes orientaciones que pueden desplazar a otras células en el embrión alrededor de moverlos dentro o fuera del plano focal original. Si el microscopio no tiene un motor de enfoque se puede ajustar manualmente el enfoque a seguir en la celda o el proceso que está interesado. </li><li> Número de entrada de puntos de tiempo e intervalo de tiempo necesario. Por lo general, utilizan el intervalo de 15 segundos y un máximo de 500 puntos de tiempo. Empezamos con los puntos de tiempo más de lo que va a necesitar y detener la adquisición cuando se desee. Si usted es de imágenes múltiples planos focales, asegúrese de que haya tiempo suficiente para adquirir la totalidad de los planos focales en el intervalo entre los puntos de tiempo. </li><li> Seleccionar o crear una ubicación para guardar los datos. Asegúrese que el software está configurado para mostrar la última imagen solamente. Dar un nombre al archivo y haga clic en Adquirir. Controlar la adquisición automática de imágenes de los puntos de tiempo de los primeros para asegurar su correcto funcionamiento. </li><li> Haga clic en Detener cuando desee detener la adquisición, el interruptor con el objetivo de 10x y preparar la siguiente diapositiva. </li><li> Cuando se hace de imágenes DIC eliminar los componentes de la trayectoria de la luz. Aceite de limpiar el objetivo, si es necesario. Apagar todo el equipo a partir de la cámara. </li></ol> GFP Películas <ol start="20"><li> Inicio microscopio y buscar embriones que el anterior. Utilice el archivo de configuración que incluye software de control de disparo fluorescentes. </li><li> Asegúrese de que el prisma superior DIC (slider) no está en la trayectoria de la luz. </li><li> Interruptor de Cubo de filtro para FITC / GFP (ajusta automáticamente en el arranque) </li><li> Cambio de ganancia cámara a 255 y el archivo de imagen a 16-bit TIFF (ajusta automáticamente en el arranque con el archivo de configuración). </li><li> Apague la luz blanca. </li><li> Haga clic en vivo de imágenes de vista preliminar. Trabaje con rapidez para reducir al mínimo la exposición de luz. Alternativamente, puede utilizar la imagen Ajustar a cobrar una sola imagen. </li><li> Ajustar la potencia de lámpara de mercurio / filtros de densidad neutra, la longitud de la exposición para obtener una buena imagen. En general, se debe utilizar la luz mínima llegar a la muestra para obtener los datos que desee reducir el daño solar a la celda y photobleaching de las señales de fluorescencia. </li><li> Establecer el intervalo de tiempo, el número de puntos de tiempo y el número de planos focales. A menudo usamos 5.10 segundos de intervalo y el plano focal 3.1. </li><li> Seleccione retorno de la inversión y establecer los parámetros para la adquisición de la imagen como se describió anteriormente en los pasos 13-19. </li></ol> Películas analizar <ol start="29"><li> Los datos se guardan en la carpeta con el nombre introducido y contienen una serie de archivos TIFF para cada imagen de la pila de 4D, un archivo de texto y un archivo de metadatos XML que contiene, tales como los niveles de exposición e intervalos de tiempo. </li><li> Las imágenes TIFF puede ser abierto por ImageJ a través de dos métodos. El primero (método a) es el más simple y también leer los metadatos de cada archivo. El segundo (método b) es capaz de usar la memoria virtual para abrir los archivos que son más grandes que la cantidad de memoria asignada a ImageJ, pero no incluye los metadatos. <ol class="lalpha"><li> Utilizando Micro-Manager Plugin <ol><li> Micro-Manager se basa en y utiliza ImageJ (que se instala una nueva versión de ImageJ que será diferente de cualquier otra versión que pueda tener previamente instalado) e incluye un plugin para abrir los datos. Alternativamente, usted puede copiar el contenido de la carpeta Micro-Manager-1.3/plugins a la carpeta de plugins para otra versión de ImageJ. </li><li> Ir al menú Plugins, seleccione Micro-Manager y luego en Abrir Micro-gestor de archivos. </li><li> Seleccione la carpeta que contiene los datos que desea ver y haga clic en Aceptar. </li><li> Juega a través de las dimensiones de Z y T. </li></ol></li><li> Utilizando LOCI plugin para abrir películas con BioFormats importador. <ol><li> La transferencia de los archivos XML y TXT en la carpeta que contiene los archivos TIFF y cambiar el nombre de los dos archivos para que coincida con el nombre del conjunto de datos. </li><li> Dentro de ImageJ, ir a los plug-ins del menú desplegable, seleccione LOCI y luego cualquiera de los navegadores de datos o formatos de Bio-importador. </li><li> Encuentre la carpeta con tus pilas tiff. Haga clic en el primer archivo tiff, a continuación, abra. </li><li> Ver pila con HyperStack. Bajo la organización del conjunto de datos: Seleccione los archivos del grupo con unas dimensiones de intercambio nombres similares, y abrir todas las series. Bajo la dirección de memoria: Seleccione: uso de la pila virtual (especialmente para grandes conjuntos de datos). Haga clic en Aceptar </li><li> El plugin determinar las dimensiones del conjunto de datos (número de puntos de tiempo y de planos focales) y mostrar el rango de entre un conjunto de &lt;&gt; entre paréntesis. Haga clic en Aceptar o alterar el número de puntos de tiempo y / o planos focales para abrir. </li><li> Confirme que la dimensión corresponde a cada serie. </li><li> Juega a través de las dimensiones de Z y T. </li></ol></li></ol></li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Alambiques Figura 1. De una película de Nomarski DIC ilustrar normal de los eventos celulares durante la primera C. elegans desarrollo del embrión: la migración pronuclear (0-5:45), primera división asimétrica (06:45-14:45) y la división asíncrona segundo (14:45-27:00). Los datos fueron recogidos con un lente de 60x 1,35 NA. 20 planos focales en intervalos de 1 micra se recogieron cada 15 segundos de exposición con 40 ms. Las imágenes fueron girados de forma que es posterior a la que está bien y ventral hacia abajo. Bar escala representan 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Fotogramas de una película fluorescentes que ilustran el dinamismo de una subunidad de GFP-etiquetado de los complejos de pasajeros cromosoma (AIR-2) presente en los cromosomas de la metafase a la anafase temprana (de A a C) antes de aparecer en la zona media del huso en la anafase hasta citocinesis completa (C a F). Los datos fueron recogidos con un lente de 60x 1,35 NA. Un solo plano focal fue recogida cada 10 segundos de exposición con 50 microsegundos. Las imágenes fueron girados de forma que es posterior a la derecha. Bar escala representan 10 micras. Movie 1 Nomarski película de tipo salvaje embriones. Película correspondiente a la Figura 1. Posterior es a la parte inferior derecha y ventral es la parte inferior izquierda. Muestra un solo plano focal del conjunto de datos original. La imagen fue recogida cada 15 segundos y la reproducción es de 14 fotogramas por segundo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">Haga clic aquí para ver el video</a> Movie 2 Movie fluorescente de tipo salvaje embriones que expresan GFP:: AIR-2. Película correspondiente a la Figura 2. Posterior es a la parte superior derecha. Película se recogió como un plano focal simple. La imagen fue recogida cada 10 segundos y la reproducción es de 14 fotogramas por segundo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">Haga clic aquí para ver el video</a>

<ol>
	<li>Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+a+stable+cohesin-chromatin+interaction+after+but+not+before+DNA+replication.">Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication.</a> Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).</li><li>Nabeshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast:+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle.">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Heuvel, S. v. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+regulation.">Cell-cycle regulation.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Gonczy, P., Rose, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division+and+axis+formation+in+the+embryo.">Asymmetric cell division and axis formation in the embryo.</a> WormBook. , 1-20 (2005).</li><li>Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+C.+elegans.">Gastrulation in C. elegans.</a> WormBook. , 1-13 (2005).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+temperature-sensitive+cell-division+mutants+of+Caenorhabditis+elegans.">A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 149, 1303-1321 (1998).</li><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans+[see+comments].">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments].</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+by+chemical+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 17, 119-121 (1997).</li><li>Liu, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+Caenorhabditis+elegans+deletion+mutants.">High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants.</a> Genome Res. 9, 859-867 (1999).</li><li>Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NemaGENETAG+initiative:+large+scale+transposon+insertion+gene-tagging+in+Caenorhabditis+elegans.">The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetica. 137, 39-46 (2009).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+analysis+of+genes+expressed+in+the+ovary+of+Caenorhabditis+elegans.">RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).</li><li>Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III.">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408, 331-336 (2000).</li><li>Sonnichsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-genome+RNAi+profiling+of+early+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 434, 462-469 (2005).</li><li>Mohler, W. A., Isaacson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Bembenek, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+granule+exocytosis+in+C.+elegans+is+regulated+by+cell+cycle+components+including+separase.">Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase.</a> Development. 134, 3837-3848 (2007).</li><li>Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+actin+cytoskeleton+and+homotypic+membrane+fusion+in+ER+dynamics+in+Caenorhabditis+elegans.">Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).</li><li>Bianchi, L., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+embryonic+C.+elegans+cells+for+electrophysiological+and+pharmacological+analyses.">Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses.</a> WormBook. , 1-15 (2006).</li></ol>

Una consideración importante para vivir el tiempo-lapse de imágenes es la de preservar la integridad y la viabilidad de la célula y el organismo. Microscopía DIC ofrece la ventaja de que la muestra no está expuesto a la luz ultravioleta y un calentamiento excesivo de la fuente de iluminación. Microscopía DIC es muy adecuado para detectar la migración de las células y cambios en las células la forma como la citocinesis y de identificar algunas estructuras subcelulares, como el huso mitótico y la membrana nuclear. Imágenes de fluorescencia de las proteínas reportero complementa microscopía DIC por identificar otros compartimentos subcelulares y que permite la visualización de proteínas específicas. Para mitigar los riesgos de fototoxicidad y daños en el embrión durante imágenes de fluorescencia, por lo general aumenta la ganancia digital de la cámara para compensar la intensidad de la luz ultravioleta y reduce la duración de la iluminación. Para los periodistas débil transgénicos fluorescentes, los algoritmos de deconvolución para reasignar fuera de foco de luz o algoritmos deblurring para reducir el fondo puede mejorar la calidad de las imágenes capturadas. Mientras que los microscopios avanzados tales como los sistemas confocal o multifotónica a veces son necesarias, hemos encontrado que muchos reporteros fluorescentes se pueden crear imágenes con esta configuración microscopio de epifluorescencia, produciendo imágenes de alta calidad. Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), además de ser gratuito, guarda los archivos directamente en formato tiff en lugar de formatos de archivos propietarios de muchos paquetes de software comercial. Esto simplifica considerablemente el análisis de nuestros datos al eliminar el paso de conversión de archivos necesario para leer los archivos de imagen ImageJ, Photoshop y otros programas de edición de imágenes.

Olympus BX61 microscopio con Hamamatsu Orca-ER cámara. Plan de Fluorita de 10x (NA 0,3) y PlanAchromat 60x (NA 1.35) lentes del objetivo Micro-Manager 3.1.46 (http://www.micro-manager.org) Imagen de J 1,43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) Agarosa - Biología molecular / grado electroforesis en gel Fisher Superfrost / Plus preparaciones para microscopio (Catálogo # 12-550-15) Laboratorio de la cinta (Fisher Catálogo # 15-901 de la serie) 18 mm x 18 mm # 1.5 Cubreobjetos M9 (242 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na 2 HPO 4, 9 mm g de NaCl, 19 mM NH 4 Cl MgSO 4) (Http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). Huevo buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM de MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3) 25. Vaselina Cepillo / Stick Hojas de afeitar Bloque de calor Microscopio de disección Gusanos 22 Alambre de platino pick 22 27G1 / 2 agujas de precisión Glide (Beckton Dickinson) o un bisturí con una hoja pequeña

imaging c. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software

Procesos celulares, como el cromosoma de la Asamblea, la segregación y la citocinesis, son inherentemente dinámico. Time-lapse de imágenes de células vivas, utilizando proteínas marcadas con fluorescencia reportero o el contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía, permite el examen de la evolución temporal de estos eventos dinámicos que se infiere de lo contrario el análisis de muestras de 1,2 fijo. Por otra parte, el estudio de las normas de desarrollo de los procesos celulares requiere la realización de experimentos con lapso de tiempo en un organismo intacto durante el desarrollo. El embrión Caenorhabiditis elegans es de color transparente y tiene un programa rápido, invariante en el desarrollo de una célula conocida linaje 3, proporcionando así un modelo de experimentación ideal para estudiar las cuestiones de la biología celular y desarrollo 4,5 9.6. C. elegans es modificable a la manipulación genética por delante la genética (sobre la base de mutagénesis aleatoria 10,11) y la genética inversa para apuntar genes específicos (basados ​​en RNAi interferencia y dirigida mutagénesis 12-15). Además, los animales transgénicos pueden ser fácilmente creados para expresar las proteínas de marcado con fluorescencia o reporteros 16,17. Estas características se combinan para hacer que sea fácil de identificar los mecanismos genéticos que regulan los procesos celulares fundamentales y de desarrollo in vivo 18-21. En este protocolo se presentan los métodos para obtener imágenes en directo de C. elegans embriones utilizando la óptica DIC y fluorescencia de GFP en un microscopio de epifluorescencia compuesto. Se demuestra la facilidad con la que los microscopios disponibles, normalmente se utiliza para obtener imágenes de muestra fijo, también se puede aplicar para realizar un análisis cronológico utilizando software de código abierto para automatizar el proceso de imágenes.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software at JoVE.com

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

La<em&gt; C. elegans</emEmbrión&gt; es un potente sistema para el estudio de la biología celular y del desarrollo. Se presenta un protocolo para obtener imágenes en vivo de<em&gt; C. elegans</em&gt; La utilización de embriones óptica DIC o de fluorescencia utilizando microscopios de epifluorescencia fácilmente disponibles y el software de código abierto.

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

imaging-c-elegans-embryos-using-an-epifluorescent-microscope-open

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

27.8K vistas.  University of Michigan. La C. elegans es un potente sistema para el estudio de la biología celular y del desarrollo. Se presenta un protocolo para obtener imágenes en vivo de C. elegans La utilización de embriones óptica DIC o de fluorescencia utilizando microscopios de epifluorescencia fácilmente disponibles y el software de código abierto.

Video: Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Investigación

Biología

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

Montaje, ajuste y uso de un microscopio de campo Apertureless de Infrarrojo Cercano para la imagen de proteínas

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en<em&gt; C. elegans</em&gt; Los embriones

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Configuración de un microscopio de luz Hoja simple para<em&gt; En Toto</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desarrollo

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...