Este protocolo describe un método para el aislamiento simultáneo de células madre fibro adipogénicas, progenitoras y musculares utilizando activadores de fluorescencia de clasificación. Las poblaciones puras de estas células son un requisito previo para comprender su papel biológico en condiciones fisiológicas y patológicas. Usando esta técnica, Forbes y las células madre musculares se identificaron y aislaron de la axila o del músculo lesionado.
La alta impunidad de Forbes y las células madre musculares nos ha permitido utilizar estas células para diferentes técnicas posteriores, como el trasplante de sacarina y el análisis de mezcla mudial. Para comenzar, coloque el ratón supino eutanasiado en una almohadilla de disección y rocíelo con etanol al 70% Para evitar la contaminación, use fórceps para pellizcar el centro de la piel del vientre del ratón y corte aproximadamente un centímetro abertura horizontalmente. Agarre los bordes de la herida y el disco en el ratón tirando de la abertura en las direcciones opuestas para descubrir los músculos debajo, exponer un lado de la extremidad posterior a la vez.
Antes de recolectar músculos, Eliminar la grasa intermuscular entre los isquiotibiales en el extremo proximal de los cuádriceps para mejorar el aislamiento de las células progenitoras fibro adipogénicas y las células madre musculares. A continuación, sin dañar el tejido, use fórceps afilados para romper y despegar la fascia para exponer los músculos debajo del tibial anterior o TA y extensor largo de los dedos o EDL. Pase la punta afilada de los fórceps debajo de los músculos TA EDL para separar los músculos de la tibia.
Corte los tendones, uniendo el TA EDL al tobillo y mientras lo sostiene con fórceps, recorte los músculos con tijeras a lo largo de la línea longitudinal del TA EDL. Corte los tendones alrededor de la rodilla para separar todos los músculos TA EDL. Coloque los músculos en un plato de seis centímetros mantenido en hielo.
Para aislar los músculos gastrocnemios, corte todos los tendones del tobillo y desprenda los músculos de la tibia y el peroné. Corte alrededor de la rodilla y transfiera los músculos al plato. Despegue la fascia alrededor del cuádriceps y sepárela del fémur pasando la punta afilada de los fórceps entre el músculo y el hueso.
Corte los tendones alrededor de la rodilla y recorte el resto del músculo cortando a lo largo del fémur mientras sostiene los cuádriceps con fórceps en el extremo distal. Coloque los músculos en el plato de seis centímetros. Separe los isquiotibiales y los músculos restantes alrededor del fémur y transfiéralos al plato.
Reúna los músculos de las extremidades posteriores en un plato que se mantenga en hielo. Aspire el medio de lavado del plato y agregue de uno a dos mililitros de tampón de disociación muscular para mantener los músculos húmedos. A continuación, pica bien los músculos Use un bisturí para rasgar y cortar el músculo y luego use tijeras para seguir cortando el músculo en trozos pequeños durante uno o dos minutos hasta obtener una pasta de lodo de tejido bien picado.
Luego transfiera los músculos picados al tubo cónico que contiene el tampón de disociación muscular. Selle los tubos con película de laboratorio e incube en un baño de agua de 37 grados centígrados con agitación durante una hora. Después de una hora, retire el tubo de la coctelera y llénelo a 50 mililitros Con el medio de lavado, invierta suavemente el tubo dos veces para asegurar la mezcla.
Centrifugar las células en un rotor de cucharón oscilante a 250 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 42 mililitros de sobrenadante en dos tubos nuevos y deje ocho mililitros en el tubo original. Llene los nuevos tubos que contienen 21 mililitros del sobrenadante hasta 50 mililitros con medio de lavado.
Luego centrifugar las celdas a 350 veces G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Aspire el sobrenadante y mantenga los gránulos en hielo. A continuación, agregue un mililitro de colágeno de dos caldo y un mililitro de caldo a base de dis en el tubo original que contiene ocho mililitros de tampón de disociación muscular.
Utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros resuspender el pellet 10 veces sin obstruir. Expulse la solución hacia la pared del tubo, evitando las burbujas de formación. Selle los tubos con película de laboratorio e incube en un baño de agua de 37 grados centígrados con agitación durante 30 minutos.
Después de 30 minutos, retire el tubo del aspirado agitador y expulse la suspensión muscular 10 veces a través de una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 20, llene cada tubo hasta 50 mililitros con medio de lavado e invierta el tubo. Luego centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Dejando ocho mililitros en el tubo original.
Llene el nuevo tubo hasta 50 mililitros con medio de lavado, vuelva a centrifugar las celdas a 350 veces G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y mantenga el pellet en hielo. Coloque un filtro de celda de nylon de 40 micras en el tubo cónico original de 50 mililitros que contiene ocho mililitros de medio de lavado y humedezca previamente el filtro con uno o dos mililitros de medio de lavado.
Mientras sostiene el colador, utilice una pipeta de 10 mililitros para resuspender el pellet suavemente. Filtre la suspensión a través del filtro celular de nuevo en el mismo tubo para minimizar la pérdida celular. Filtre los otros gránulos del tubo de nuevo en el tubo original agregando de cuatro a cinco mililitros de medio de lavado a cada tubo para resuspender los gránulos y transferir la solución al colador automático colocado en el tubo original.
Después de recoger todos los gránulos en el tubo original de 50 mililitros, enjuague el colador automático con otros cuatro a cinco mililitros de medio de lavado. Utilice una pipeta de 1000 microlitros para recoger todo el líquido de la parte inferior del colador automático. Llene cada tubo con medio de lavado de hasta 50 mililitros e invierta el tubo.
Centrifugar el tubo a 250 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante inmediatamente sin alterar el pellet y vuelva a suspender el pellet en 600 microlitros de medio de lavado. Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Agregue anticuerpos CD 31 APC CD 45 APC SCA un Pacific Blue VCAM una biotina y alfa siete Integrina PE en un tubo de dos milímetros que contenga suspensión celular. Mezcle e incube suavemente las células en un agitador giratorio a cuatro grados centígrados durante 45 minutos protegiéndolas de la luz. Después de la incubación, llene todos los tubos hasta dos mililitros con medio de lavado y centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 300 microlitros de medio de lavado. A continuación, agregue el anticuerpo de estreptavidina en tubos e incube las células en un agitador giratorio a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, llene los tubos que contienen anticuerpos contra la estreptavidina hasta dos mililitros con medio de lavado.
Luego, centrifugar los tubos y aspirar el sobrenadante por completo. Después del segundo lavado, resuspenda las células en el tubo experimental en 500 microlitros de medio de lavado. Moje previamente una tapa de filtro celular de un tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros con 200 microlitros de medio de lavado.
Transfiera la suspensión celular del tubo experimental al tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros y permita que se filtre por gravedad. Imprima el tubo de dos mililitros que contiene la suspensión de muestra experimental con 300 microlitros de medio de lavado y páselo a través del mismo tapón filtrante. Utilice una pipeta de 200 microlitros para recoger todo el líquido de la parte inferior del filtro celular.
Selle con una tapa, deje los tubos en hielo y protéjalos de la luz. Aquí se muestra la estrategia de compuerta adoptada para el aislamiento de progenitores fibro adipogénicos y células madre musculares. El golpe PD GFR alfa E G F P en ratones reporteros expresa el gen de fusión H two B E G F P del locus alfa endógeno PD G FFR, lo que permite un etiquetado eficiente y específico del linaje alfa PD G GF.
La pureza de las poblaciones celulares aisladas se confirmó mediante inmunotinción de cocultivo de progenitores fibro adipogénicos positivos para GFP y células madre musculares con anticuerpos PAC-siete. El progenitor fibro adipogénico positivo para GFP no expresó el marcador PAC-siete, mientras que las células madre musculares reaccionaron con este anticuerpo. Todas las células que expresan GFP fueron positivas para SCA uno y negativas para CD 31, CD 45 VCAM uno e integrina alfa siete.
Se muestran el progenitor fibro adipogénico y las células madre musculares aisladas de ratones lesionados con inyecciones intramusculares sin toxina siete días después de la lesión. A medida que las células madre musculares se activan un aumento en el tamaño celular. Es importante ajustar los parámetros F SCA y SS CA y expandir la puerta para incluir esas celdas en el centro.
Aquí se muestra la cuantificación de progenitores fibro adipogénicos y células madre musculares en músculos TA no lesionados y siete días después de la lesión. Aunque el pico y la proliferación se observaron entre los días dos y tres, una baja tasa de proliferación de células seguía siendo apreciable siete días después de la lesión. Realizar una picada muscular adecuada es de vital importancia para liberar una sola célula.
Además, el aislamiento de células mononucleótidas se logra ejecutando la suspensión a una jeringa de 10 mililitros con una aguja calibre 20. Esta técnica ayudará a los científicos a estudiar el perfil biológico transcripcional y epigenómico de Forbes y las células madre musculares en condiciones normales y durante las etapas más profundas de la regeneración muscular.
