Aislar las células progenitoras musculares humanas que regulan la regeneración muscular esquelética nos permite investigar procesos que subyacen al proceso regenerativo conservando al mismo tiempo la variabilidad del donante. Esta técnica permite obtener grandes rendimientos de células progenitoras musculares humanas a partir de pequeñas cantidades de tejido y su análisis fenotípico utilizando un pequeño número de células. Este método está diseñado específicamente para aislar las células progenitoras musculares humanas para rastrear sus capacidades de proliferación y diferenciación y para relacionar estos datos con el proceso regenerativo del músculo esquelético.
El aspecto más difícil de esta técnica bastante sencilla es asegurar que cada paso se realice reproduciblemente para optimizar el rendimiento y la pureza de las células. Hay varios pasos que deben completarse para el aislamiento correcto de las celdas. Varios de los pasos son más fáciles de entender si se observan visualmente.
Para aislar las células progenitoras musculares humanas del tejido de la biopsia, coloque el tejido muscular en una placa estéril de Petri en condiciones estériles, y use un bisturí estéril para picar el tejido en trozos en cubos de un milímetro. Cuando todo el tejido haya sido picado, transfiera las piezas a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS, y permita que los tejidos se asienten por gravedad antes de aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el tejido. Después de lavar los fragmentos por segunda vez como acaba de demostrar, reemplace el PBS por 10 mililitros de medio Eagle modificado de Dulbecco de baja glucosa.
Retire el sobrenadante después de que los tejidos se hayan asentado, y resuspendir las piezas en tres mililitros de medio de digestión. Coloque los tejidos a 37 grados centígrados durante 30 minutos, con la trituración de los fragmentos musculares cada 10 minutos con una pipeta serológica de un mililitro. Al final de la incubación, añadir 83 microlitros de medio de digestión adicional y 24 microlitros de solución dispase a las muestras, y triturar los tejidos cada cinco a 10 minutos con una punta de pipeta de diámetro ancho hasta que se logre una suspensión uniforme.
Una suspensión uniforme es importante para la recuperación máxima de las células progenitoras musculares humanas. Continúe la digestión si la suspensión no pasa a través de una punta de pipeta estándar de 1.000 microlitrotro. Para aislar las células pax7-positivas, manche y enciñe las células de acuerdo con el protocolo.
Ordene las células progenitoras de músculo humano CD56, CD29 doble positivas en un citómetro de flujo con una boquilla de 100 micrómetros a una presión de 20 libras por pulgada cuadrada en tubos de recolección que contienen un cojín de 300 microlitros de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia. Luego siembra las células progenitoras musculares humanas ordenadas en placas de 24 pozos recubiertas de colágeno que contienen un medio de crecimiento precalentado a una concentración de 3,5 veces 10 a las cuartas células por centímetro de concentración cuadrada. Para realizar exploraciones de confluencia, cargue la placa en un citómetro de imagen y seleccione Crear nuevo escaneo y la categoría de placa, Perfil de placa e ID de placa.En Aplicación, seleccione Confluencia y Confluencia 1 y seleccione un pozo para ver.
Busque un plano de enfoque en el que las celdas aparezcan blancas en comparación con el fondo y seleccione Registrar manual. Utilice el ratón para resaltar todos los pozos que deben analizarse y seleccione Iniciar análisis. Toda el área del pozo se escaneará automáticamente.
Seleccione la configuración de análisis que sea óptima para el tipo de placa y celda y seleccione Iniciar análisis. Utilice el citómetro de imágenes para medir la confluencia inicialmente. Luego, para contar las células en el citómetro de imagen, reemplace el medio en cada pozo con 200 microlitros de solución de tinción.
Después de 15 minutos a 37 grados Centígrados, sustituya la solución de tinción por 100 microlitros de F12 de Jamón fresco. Devuelva la placa al citómetro de imagen y, en Aplicación, seleccione Viabilidad celular y Total vivo muerto. El canal Live será una imagen de campo brillante, el canal Dead mostrará la tinción de yoduro propidium, y el canal Total será la tinción Hoechst 33342.
En Configuración de enfoque, haga clic en Registrar automático. En el canal Total, establezca el canal en azul. Utilice Buscar enfoque para enfocar los núcleos y haga clic en Establecer desfase para seleccionar el foco.
En el canal Muerto, establece el canal en rojo y usa Buscar enfoque para enfocar las celdas muertas. Haga clic en Establecer desfase para seleccionar el foco y seleccione Iniciar análisis para iniciar el análisis. A continuación, seleccione los parámetros de análisis adecuados para la placa y el tipo de celda y seleccione Iniciar análisis para iniciar el análisis.
Cuando se complete el análisis, compruebe visualmente que el análisis contó correctamente las celdas. Si el escaneo y el análisis son satisfactorios, devuelva la placa a la incubadora, de lo contrario vuelva a escanear o modificar los parámetros de análisis. Las células progenitoras musculares humanas se pueden identificar mediante los primeros eventos de gating basados en el área de dispersión lateral y hacia adelante para eliminar las células muertas o los desechos, seguido de seleccionar sólo las células que son negativas para 7-AAD y por lo tanto son viables.
Las células que son positivas para los marcadores de superficie celular CD56 y CD29 representan la población de células progenitoras musculares humanas. Las células progenitoras musculares humanas también se pueden identificar por su expresión Pax7. De hecho, Pax7 se enriquece en la población total después de FACS y se mantiene a través de múltiples pasajes.
Aquí, se muestra un análisis de confluencia representativo. Los contornos verdes fueron generados por el citómetro de imágenes y muestran cómo el citómetro de imágenes determinó la confluencia en función de los ajustes de análisis seleccionados. El recuento de heterogeneidad y núcleos es común entre los donantes.
Descubrir y caracterizar con precisión esta heterogeneidad es una aplicación clave del citómetro de imagen. Las mediciones de confluencia y el recuento de núcleos de donantes únicos, sin embargo, están altamente correlacionados. Las células progenitoras musculares humanas diferenciadas para formar miotubos se pueden distinguir por su expresión de cadena pesada de miosina embrionaria.
Es importante ser consistente al seleccionar los parámetros de medición en el citometro de flujo para aislar la misma población de células de cada donante. Una vez aislado, células progenitoras musculares humanas se pueden utilizar para múltiples propósitos, incluyendo la identificación de los requisitos metabólicos únicos de proliferación y diferenciación de las células progenitoras musculares humanas. El aislamiento de las células progenitoras musculares humanas ha permitido la discriminación de las diferencias en la expresión del marcador de superficie celular en las células progenitoras musculares humanas y de ratón.
