Este protocolo es necesario para evaluar los diferentes roles de elementos bioquímicos definidos en el núcleo y el citoplasma y para analizar las interacciones intracelulares entre estos dominios dentro de varias líneas celulares. Esta técnica utiliza equipos de laboratorio y reactivos comunes para separar de manera más eficiente las fracciones citoplasmáticas y nucleares. Este protocolo puede hacerlo de manera menos costosa y más rápida que otros protocolos.
A medida que los estudios sobre las interacciones citoplasmáticas y nucleares se generalizan, el impacto de la localización en los eventos intracelulares puede comprenderse mejor. El intercambio entre el citoplasma y el núcleo puede ser analizado, indicando si ciertas moléculas durante estos intercambios pueden conducir al desarrollo del cáncer, como han indicado los estudios sobre proteínas nucleares. El paso más crítico en el protocolo es modificar la concentración del tampón de lisis a una concentración adecuada.
Como el uso del tampón de lisis depende en gran medida de la interrupción de las membranas celulares y existen variantes naturales en la efectividad del tampón de lisis en diferentes líneas celulares. Para empezar, granular las células, utilizando tubos de 1,5 mililitros por centrifugación durante cinco minutos a 2000 G.Desechar el sobrenadante con una pipeta aspiradora. Resuspender el pellet en 300 microlitros de tampón de lisis helada.
Luego, gire los tubos a una velocidad de alrededor de 12, 000 G a cuatro grados centígrados durante dos minutos. Retire con cuidado el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo de 1,5 mililitros. El pellet restante será la fracción nuclear.
A continuación, agregue 500 microlitros de PBS helado al pellet y centrifugar a 2000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Para confirmar la separación de los compartimentos usando qPCR, primero, convierta el ARN en ADN complementario utilizando un kit disponible comercialmente. Preparar la mezcla maestra de transcriptasa inversa.
Agregar ARN de plantilla. Incubar reacciones en un termociclador. Proceder a realizar la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y el análisis.
Comience diluyendo la síntesis de ADNc con agua DEPC para tener una concentración final de 20 nanogramos por mililitro. Usando una mezcla maestra de PCR, prepare la reacción para cada muestra usando instrucciones manuales. Adquirir sondas comerciales necesarias para detectar fraccionamiento citoplasmático y nuclear.
Utilice MALAT1 como marcador nuclear y TUG1 como marcador citoplasmático. Calcule el volumen de cada componente multiplicando cada componente por tres para cada una de las réplicas técnicas para la muestra individual. Para cada muestra nuclear y citoplasmática, adquirir las mezclas fracción nuclear con MALAT1, fracción citoplasmática con MALAT1, fracción nuclear con TUG1 y fracción citoplasmática con TUG1.
Vortex brevemente para mezclar soluciones y transferir 20 microlitros de la mezcla a cada pocillo de una placa de reacción óptica. Cubra la placa con una película adhesiva transparente utilizada para qPCR y centrifugue la placa brevemente para eliminar las burbujas de aire, y luego gire la muestra a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Utilizando software de diseño y análisis, seleccione la curva estándar para los parámetros de ciclismo.
Con el software qPCR, seleccione setup run (ejecutar setup). En la página de propiedades del archivo de datos, seleccione el método y los parámetros del ciclo de entrada. Después de ingresar los parámetros del ciclo, seleccione la pestaña de la placa e ingrese las muestras que se ejecutarán.
Seleccione iniciar ejecución. Una vez completada la ejecución, cree una hoja de cálculo de datos con el nombre de la muestra, el nombre del destino y el ciclo de cuantificación. Comience con las muestras MALAT1 para calcular la fracción nuclear.
Resta la fracción citoplasmática MALAT1 de la fracción nuclear MALAT1. Continuar con las muestras MALAT1 para calcular la fracción citoplasmática. Reste la fracción nuclear MALAT1 de la fracción citoplasmática MALAT1 y luego calcule las dos elevadas a CQ delta negativa. Realizar los cálculos con muestras TUG1.
Cuando TUG1 está presente como un control positivo para los elementos citoplasmáticos, se espera que los niveles de fraccionamiento citoplasmático sean más altos que los niveles de fraccionamiento nuclear. Un resultado negativo donde se observan niveles de fraccionamiento citoplasmático en la muestra con MALAT1. Esto indica contaminación de ARN aislado de la fracción nuclear, potencialmente debido a concentraciones de lisis que son demasiado bajas o demasiado altas.
MALAT1 y TUG1 mostraron la mayor correlación con la separación nuclear y citoplasmática confirmada a través de un Western blot y electroforesis de ARN, que confirmó la pureza y calidad de las muestras. Además, la pureza de los extractos nucleares y citoplasmáticos se puede demostrar mediante un Western blot utilizando lamina como marcador para la fracción nuclear y alfa-tubulina como marcador positivo para la fracción citoplasmática. No se observó ningún pico en la electroforesis de ARN citoplasmático, demostrando alta calidad y poca o ninguna contaminación en la muestra de ARN citoplasmático.
El uso de tampón de lisis es crítico para el fraccionamiento adecuado y es esencial optimizar la concentración del tampón de lisis a la línea celular de interés deseada. Esta técnica permite el estudio específico de la interacción nuclear y citoplasmática, que es ampliamente aplicable a una variedad de temas de investigación y permite una mejor comprensión de cómo la localización de elementos biológicos específicos puede correlacionarse con su función.
