Desarrollar técnicas para investigar el transporte de macromoléculas entre el núcleo y el citoplasma, e identificar la mala localización de las proteínas supresoras de tumores es esencial para obtener una comprensión más profunda de la patogénesis de la LLC y ayudar en el desarrollo de nuevas terapias. Este protocolo proporciona un método rápido y eficiente para generar fracciones nucleares y citoplasmáticos a partir de células CLL primarias. Estas fracciones se pueden utilizar en experimentos posteriores, incluidos ensayos de actividad enzimática, análisis proteómico e hinchazón occidental.
Esta técnica ampliará nuestra comprensión de cómo las terapias y las señales microambienales dentro de los tumores alteran el cierre de proteínas entre el núcleo y el citoplasma en las células CLL y potencialmente otras neoplasias malignas de células B. Este método se puede utilizar para determinar la ubicación de las proteínas y/o atraer el movimiento de proteínas según corresponda. Realice un gradiente de detergente en cada línea celular individual que planee utilizar para garantizar la generación óptima de fracciones nucleares y citoplasmáticos altamente enriquecidas.
Junto a Jodie Hay y Michael Moles, demostrando este procedimiento estará Jennifer Cassels, una técnico de mi laboratorio. Obtener muestras de sangre periférica de pacientes con leucemia linfocítica crónica previamente consentidas en tubos de recolección de sangre EDTA, acompañados por el recuento de glóbulos blancos. Las muestras de sangre humana deben considerarse peligrosas, ya que potencialmente contienen virus transmitidos por la sangre.
Asegúrese de que estas muestras se manipulan en un gabinete de biosecuestos de clase dos y de que el usuario lleva una bata de laboratorio y guantes en todo momento. Deseche los materiales contaminados con sangre en los desinfectantes. Si el recuento de células blancas es igual o superior a 40 millones de células por mililitro, diluya la muestra en una proporción de uno a uno con el búfer de lavado RT CLL.
A continuación, aliquot RT densidad media en un tubo de centrífuga cónica de tamaño adecuado para la muestra. Capa cuidadosamente la muestra en la parte superior del medio y centrífuga a 400 x g durante 30 minutos en RT. Con una pipeta Pasteur de plástico, cosecha suavemente la capa blanca de células mononucleares que se recogen en la interfaz del medio de gradiente de densidad en el tampón de lavado CLL. Transfiera esta monocapa aislada a un tubo de centrífuga cónica fresco de 50 mililitros.
Para lavar las células, agregue 40 mililitros de tampón de lavado CLL a esta monocapa y centrífuga a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante, deslice la parte inferior del tubo para volver a suspender el pellet y repita este lavado. Deseche el sobrenadante, deslice la parte inferior del tubo de nuevo y, a continuación, vuelva a suspender el pellet celular en un volumen establecido de tampón de lavado CLL dependiendo del tamaño del pellet.
Después de contar las células y después de la citometría de flujo para comprobar la pureza celular, coloque las células en placas de cultivo de tejido en la densidad celular requerida lista para la estimulación o el tratamiento farmacológico. Después de la estimulación y/o tratamiento farmacológico, la incubación es completa. Transfiera las células a tubos de microfusión de 1,5 mililitros y pellets etiquetados individualmente centrifugando a 200 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo celular en un mililitro de PBS helado con inhibidores de la fosfatasa. Centrifugar a 200 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y mantenga estos pellets de extracto de células enteras sobre hielo para preparaciones adicionales.
Para preparar fracciones citoplasmáticas, vuelva a suspender suavemente los gránulos celulares en 50 microlitros de 1x tampón hipertónico. Para permitir que las células se hinchen, incubarlas sobre hielo durante 15 minutos. Después de realizar un gradiente de detergente para determinar la concentración óptima de detergente para un tipo de célula específico, agregue 0,8 a 2,5 microlitros de detergente en cada muestra y vórtice en el ajuste más alto durante 10 segundos.
Para verificar la lysis celular, observe las células bajo un microscopio de contraste de fase antes y después de la adición de detergente. Todas las células tienen un núcleo denso y oscuro rodeado por el citoplasma que aparece como un halo brillante. Una vez lanchadas, centrifugar las muestras a 14.000 x g durante 30 segundos a cuatro grados centígrados.
Con cuidado, sin alterar el pellet, transfiera el sobrenadante a un tubo de microfure pre-refrigerado etiquetado y almacene esta fracción citoplasmático a 80 grados centígrados hasta su posterior análisis. Asegurar la eliminación completa de la fracción citoplasma para evitar la contaminación de la fracción nuclear. Al pellet restante, que contiene la fracción nuclear, añadir 50 microlitros de tampón de lelisis completo y volver a suspender por pipeteo arriba y abajo.
Para solubilizar las proteínas asociadas con la membrana nuclear, añadir 2,5 microlitros de detergente, vórtice en el ajuste más alto durante 10 segundos e incubar sobre hielo durante 30 minutos. Vórtice en el ajuste más alto durante 30 segundos y centrífuga. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de microfureje pre-refrigerado etiquetado y almacene esta fracción nuclear a 80 grados centígrados hasta su posterior análisis.
Para los dosatos de células enteras, vuelva a suspender los pellets de extracto de células enteras en 100 microlitros de tampón de lelisis completo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Para asegurar la lelisis celular completa, agregue cinco microlitros de detergente e incubar sobre hielo durante 30 minutos. Vórtice en el ajuste más alto durante 30 segundos y luego centrifugar a 14.000 x g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.
Transfiera el sobrenadante en un tubo de microfugo pre-refrigerado y almacene todo el izado celular a 80 grados Celsius hasta su posterior análisis. Para cuantificar el tráfico de proteínas entre fracciones nucleares y citoplasmáticos, realice análisis cuantitativos de manchas occidentales e importe las imágenes. Para mostrar la imagen en la cinta de opciones Imagen, haga clic en el botón Elegir del grupo Visualización y haga clic en Canal Chemi.
Se abrirá el cuadro de diálogo Elegir visualización para habilitar más ajustes si es necesario. Implemente mejoras adicionales utilizando los controles deslizantes ajustables en la pestaña del LUT de la imagen, incluido el brillo o el contraste. Utilice la pestaña Curvas para realizar ajustes más precisos.
Para el análisis de datos, primero haga clic en la cinta de opciones Análisis. Para analizar solo un canal, anule la selección de los canales que no se están analizando haciendo clic en la miniatura de Don't Show Channel de un canal, dejando solo el canal deseado mostrado. Para cuantificar la intensidad de la señal, haga clic en Agregar rectángulo para agregar rectángulos a la imagen.
Haga clic en el centro de una entidad, como una banda de proteínas, para colocar un rectángulo alrededor de ella. Después de agregar las formas deseadas, haga clic en Seleccionar para devolver el cursor a la herramienta de selección. Para restar el ruido de fondo, haga clic en el primer botón del grupo Fondo y seleccione Mediana en el menú desplegable.
Establezca el ancho del borde en tres en el cuadro de diálogo Fondo y seleccione los segmentos que mejor representen el fondo de la imagen que se utilizará para el cálculo de fondo. Para exportar los datos, haga clic en la pestaña Formas situada encima de la tabla. Para la densitometría, se requieren valores en la columna Señal.
La señal es la suma de los valores de intensidad de píxel o total de una forma menos el producto del fondo en el área. A continuación, haga clic en el botón Informe, haga clic en Guardar como o Iniciar hoja de cálculo. Para calcular la expresión normalizada de la proteína de interés para cada plano o variable dentro de la hoja de cálculo guardada, divida la señal obtenida para la proteína de interés por la señal para la banda de control de carga de proteínas correspondiente.
Para exportar la imagen, haga clic en la pestaña Imágenes que se encuentra encima de la tabla y, a continuación, haga clic en la imagen que se va a exportar. Si utiliza la imagen para una presentación de diapositivas u otros formatos digitales, haga clic en el icono de software, coloque el cursor sobre Exportar, haga clic en Imagen para medios digitales y, a continuación, guarde la imagen según sea necesario. El enriquecimiento de células CLL con un CMI superior a 40 millones por mililitro utilizando centrifugación de densidad permite una recuperación celular alta.
El análisis de la muestra por citometría de flujo después de gating en FSC y SSC revela que la pureza de las células CLL es superior al 95%, como lo indica la expresión de doble superficie de los marcadores de células CLL, CD19 y CD5. Cuando se realizaron manchas de inmuno en las fracciones resultantes de la línea celular CLL, Mac-1, y células CLL primarias, el fraccionamiento indicó que el nivel óptimo de detergente para las células Mac-1 estaba en una a 60 dilución, en comparación con uno a 30 para las células CLL primarias. Cuando se determinó la localización subcelular de FOXO1 en fracciones nucleares y citoplasmáticos en células Mac-1 y células CLL primarias, la generación de fracciones altamente enriquecidas se mostró por la expresión casi exclusiva de lamina en la tubulina nuclear y beta en las fracciones citoplasmas.
La expresión FOXO1 se redujo en el citoplasma tras el tratamiento con AZD 8055, en comparación con NDC, acompañado de un aumento de la expresión de FOXO1 en el compartimento nuclear, demostrando así la translocación de proteínas. Después de que se cuantificaron las manchas de inmuno individuales de cinco muestras primarias de LLC dentro de fracciones subcelulares, se encontró que AZD 8055 reducía los niveles de expresión de FOXO1 en el citoplasma y aumentaba la expresión en el núcleo. La reticulación del BCR aumentó la expresión citoplasmático FOXO1.
Recuerde mantener todos los reactivos y muestras sobre hielo para evitar la degradación de las proteínas. Las fracciones subcelulares generadas en este procedimiento también se pueden utilizar en ensayos de actividad enzimática como un ensayo de actividad FOXO, que permite trazar paralelismos entre la ubicación celular de FOXO1 y su actividad de unión al ADN. El desarrollo de esta técnica nos ha permitido abordar el tráfico de proteínas específicas dentro de las células CLL en respuesta a inhibidores selectivos y apoya nuestros estudios paralelos de inmunofluorescencia para generar un conjunto de datos robusto y cuantificable.
