Este método puede ayudar a estudiar el desarrollo cerebeloso humano temprano y cómo podría alterarse en los trastornos neuropsiquiátricos. La ventaja clave de este método es generar células cerebelosas humanas tempranas en desarrollo en una estructura de capa 2D sin realizar pasos complicados. También es rentable.
Hacer pipetas de tracción puede ser complicado al principio, pero con la práctica y el tiempo, es más fácil tirar de las pipetas de una manera que sea más fácil de trabajar. Comience la preparación experimental tirando de una pipeta Pasteur de 22,9 centímetros aproximadamente dos centímetros por debajo del cuello, por encima del quemador bunsen para crear dos pipetas de vidrio. El lado más delgado será aproximadamente cuatro centímetros más corto que el otro.
Doble las puntas del lado tirado sobre la llama para crear una R suave, luego coloque las pipetas tiradas en las mangas del autoclave y esterilícelas en un autoclave. En el día cero, agregue un mililitro de medio de diferenciación cerebelosa suplementado con 10 micromolares Y-27632 y SB-431542 a cada pocillo de una placa de accesorio ultra bajo de seis pocillos, o ULA, y colóquelo en la incubadora hasta que las colonias levantadas estén listas para agregarse a los pocillos. Limpie las células diferenciadas con una pipeta de vidrio tirado.
Aspire el medio y agregue un milímetro de solución de paso iPSC por cada plato de 35 milímetros. Después de tres minutos de incubación a 37 grados centígrados, aspirar el medio y añadir dos milímetros de medio de diferenciación cerebelosa suplementado con 10 micromolares Y-27632 y SB-431542 Bajo un aumento de 4x de un microscopio invertido de luz transmitida, levante las colonias utilizando el borde doblado de la pipeta de vidrio tirado. Una vez que se levante cada colonia, transfiera suavemente todas las colonias a un pocillo de la placa ULA de seis pocillos utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros.
Repita este proceso para cada placa iPSC e incube las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. En el segundo día, agregue FGF2 a cada pocillo para ajustar una concentración final de 50 nanogramos por mililitro. En el séptimo día, cambie un tercio del medio aspirando un mililitro de medio gastado y reemplazándolo con un mililitro de medio de diferenciación cerebelosa fresca.
Incubar los cuerpos embrioides durante siete días. El día 14, agita la placa para reunir todos los cuerpos embrioides en el centro de la placa. Luego incline la placa y aspire todo el medio gastado usando un pipetter de 1000 microlitros desde el borde.
A medida que la cantidad media disminuye, coloque lentamente la placa plana y continúe aspirando, dejando suficiente medio para evitar sacar los cuerpos embrioides. A continuación, agregue tres mililitros de medio de diferenciación cerebelosa fresca suplementado con 10 micromolares Y-27632. Luego transfiera los cuerpos embrioides usando una pipeta serológica de 10 mililitros a un plato recubierto de poli-L-ornitina laminina.
El día 15, aspirar el medio y reemplazarlo con un medio de diferenciación cerebelosa fresca. En el día cero, las colonias de iPSC se limpiaron y se elevaron en un medio de diferenciación cerebelosa que contenía SB-431542 e Y-27632 y se colocaron en placas de fijación ultra bajas para generar cuerpos embrioides. La adición de FGF2 en el segundo día y un cambio de 1/3 de medio en el séptimo día dio como resultado cuerpos embrioides que mostraron agrandamiento en el día 14.
Las células comenzaron a migrar hacia afuera desde los cuerpos embrioides a lo largo de la superficie recubierta en el día 15. El cambio completo del medio al medio de maduración cerebelosa a partir del día 21 dio como resultado una monocapa de células con morfología y complejidad neuronales para el día 35. El análisis de expresión génica en el día 35 reveló que las células expresan marcadores progenitores cerebelosos tempranos como progenitores glutamatérgicos, ATOH1, progenitores GABAérgicos, PTF1 alfa y los marcadores celulares progenitores de Purkinje KIRREL2 y SKOR2.
Además, también se observó la expresión del marcador rómbico del labio OTX2 y en su mayoría de la neurona anterior específica SIX3. El marcaje inmunofluorescente de las células recolectadas en el día 35 mostró tinción positiva para los marcadores cerebelales EN2 y PTF1 alfa, el marcador neuronal beta tubulina III y el marcador de proliferación KI67. La tinción nuclear con 4'6-diamidino-2-fenilindol, o DAPI, mostró núcleos celulares.
Para una diferenciación exitosa, es crucial comenzar con colonias de iPSC sanas e indiferenciadas y usar reactivos que estén lo más recién reconstituidos posible.
