We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission&#8217;s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the &#8220;Stem Cells Call for Proposals.&#8221; This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by &#8220;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&#8221;.

1. Etiquetado Axonal <ol><li> Escalada fibras pueden ser etiquetados mediante la inyección de cualquiera de los tintes orgánicos conjugados con dextranos de alto peso molecular o de plásmido / virus que inducen la expresión de proteínas fluorescentes 26-29. En este protocolo, el colorante orgánico Alexa Fluor 488 dextrano se inyecta en la oliva inferior para etiquetar fibras trepadoras y visualizarlos en la corteza cerebelosa (Figura 1). Todos los procedimientos descritos aquí han sido aprobados por el Ministerio de Sanidad italiano. </li><li> Preparar el tubo capilar de vidrio tirando de él en un extractor de micropipeta. Recorte la punta del tubo capilar de vidrio con tijeras hasta que el diámetro externo es de aproximadamente 30 micras. </li><li> Cargue el capilar con 1-2 l de la teñir-dextrano conjugado. </li><li> Antes de comenzar, esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en un autoclave. Durante el procedimiento, reducir los riesgos de contaminación por el uso de un esterilizador de cuentas de vidrio. </li><li> Anestesiar el ratón (9-12semanas) mediante inyección intraperitoneal de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (9 mg / kg). Asegúrese de que el animal está completamente sedado utilizando cola y / o pellizcos del dedo del pie. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. </li><li> Afeitar el vello por encima del cuello, ya sea con una hoja de afeitar o crema depilatoria. Limpie el sitio de la cirugía dos veces con betadine, alternado con etanol al 70%. </li><li> Coloque el ratón sobre un soporte estereotáxica. Mantenga al animal caliente con una almohadilla térmica. </li><li> Empuje suavemente las earbars en el hueso al lado de los oídos para que la cabeza se mantiene con firmeza. Girar la cabeza para formar un ángulo de 140 ° con el cuerpo. La orientación deseada se puede conseguir cambiando suavemente la altura de la varilla de soporte de la nariz en el soporte estereotáctica. </li><li> Aplique unas gotas de lidocaína en la piel entre las orejas. El uso de fórceps o una hoja de afeitar para llevar a cabo una incisión vertical de aproximadamente 1 cm en la piel por debajo de la protuberancia occipital. </li><li> Separar suavemente el tejido subcutáneo y los músculos por pinza romas bajo el microscopio de disección. Empuje hacia abajo el haz muscular horizontal y mantenga separados los dos fascículos musculares verticales a fin de exponer la duramadre por encima del foramen magnum. </li><li> Usando extremo cuidado, diseccionar la duramadre con una aguja de jeringa o pinzas muy afiladas para exponer el tronco cerebral. Una pequeña cantidad de fluido cerebro-espinal puede derramarse cuando la dura ha sido cortado. </li><li> En el micromanipulador estereotáctica, girar el soporte del capilar 45 ° de la vertical. Coloque el capilar en la línea media, en el punto medio entre el extremo caudal de la corteza cerebelar y la primera vértebra cervical. Inserte la pipeta a una profundidad de 2 mm desde la superficie. </li><li> Entregar un volumen 0,5-1,5 l de tinte durante 10-15 min. Un sistema de dispensación de microinyección permite la entrega controlada de la presión del líquido en el capilar (presión de pulso = 20 psi; duración de pulso = 3-4 mseg; frecuencia de pulso de entrega = 12 Hz). </li><li> Deje el capilar en su lugar durante 15 min, a continuación, slowly (en 2-3 min) quitarla. Delicadamente realinear los músculos y suturar la piel por encima. Mantenga los músculos bien hidratados aplicando alguna solución salina a través de todo el procedimiento. </li><li> Para evitar la deshidratación, se inyecta por vía subcutánea 0,5 ml de NaCl al 0,9%. Mantenga al animal en una jaula calienta hasta la recuperación total de la anestesia. </li><li> Por vía subcutánea administrar Carprofeno (5 mg / kg) al día durante 2-3 días después de la cirugía. </li></ol> 2. Ventana óptica en la corteza cerebelosa NOTA: El colorante es transportado en 2 semanas desde el núcleo olivar inferior hasta la corteza cerebelosa a los terminales de SFC (ver Figura 1). Los FCs escasamente marcados pueden ser visualizados debajo de la ventana craneal permanente que se puede realizar de la siguiente manera: <ol><li> Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos. </li><li> Se anestesia el ratón como se describe anteriormente. Utilice pellizcos del dedo del pie para comprobar que el animal está completamente sedado. </li><li> Afeitar el cabello por encima de la cabeza, limpie el skcon alternancia de golpes de 70% de alcohol y betadine y aplicar pomada para los ojos. Coloque el ratón en un marco estereotáxico y coloque las barras de oído con el fin de sujetar firmemente la cabeza. </li><li> Por vía subcutánea administrar dexametasona (0,2 mg / kg) y carprofeno (5 mg / kg) para prevenir la inflamación del cerebro y posibles inflamaciones en el lugar de la ventana craneal. </li><li> Aplique una gota de lidocaína en la piel sobre el cráneo y cortar una solapa, de entre los oídos para arriba de los ojos. Aplicar una solución de lidocaína de nuevo en el periostio antes de raspar con un escalpelo. </li><li> Utilice el taladro dental para diluir una región semicircular del cráneo por encima del cerebelo. La ventana se coloca generalmente central y hacia la sutura de vuelta, de modo que la profundidad del cráneo es casi constante en todo el perímetro del semicírculo. Colocar la ventana demasiado cerca de la sutura lambda y de perforación repetitivo sobre esta región muy grueso puede dar lugar a un sobrecalentamiento del cerebro y la formación de edemas. </li><li> Aplicar hemostáticoesponja sobre el cráneo en caso de sangrado. </li><li> Corte un cubreobjetos en dos mitades con la ayuda de una cuchilla de afeitar y pinzas. Compruebe que el cubreobjetos es ligeramente más grande que la isla de los huesos y tiene una forma similar antes de quitar la tapa de la médula con las pinzas; si no, cambiar la forma del cubreobjetos o elegir otro tema. No toque la duramadre con las pinzas mientras se dibuja en el hueso. Coloque con cuidado por el cubreobjetos sobre la dura. NOTA: El cumplimiento de la totalidad de la superficie del vidrio en la duramadre está prediciendo de largas ventanas craneales duraderos. </li><li> Eliminar las burbujas de aire bajo el cristal de un enjuague varias veces con solución salina y secado con bastoncillos de algodón. Esto también ayudará a quitar un poco de sangre residual que pueda derramarse hacia fuera de pequeños capilares después de colocar el cristal. Sellar la ventana con una mezcla de pegamento acrílico y cemento dental 30. </li><li> Mantenga al animal en una almohadilla térmica en una cámara de recuperación hasta que se recupere completamente de la anestesia. No vuelva aconvertir ratones en la jaula hasta que se recupere plenamente; no los deje sin supervisión hasta que recobró el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. </li><li> Por vía subcutánea administrar Carprofeno (5 mg / kg) al día durante 2-3 días después de la cirugía. </li></ol> 3. En Vivo multi-fotón Láser Axotomía <ol><li> Espere 2-7 días de la cirugía antes de realizar la primera sesión de imágenes. La costumbre construido microscopio de dos fotones utilizado aquí se proporciona con un Ti: Sapphire fuente láser (120 fs pulsos de ancho, frecuencia de repetición de 90 MHz), que primero es escaneado por un par de galvanómetros de espejo y luego se centró sobre la muestra por una inmersión en agua 20X objetivo (NA 0,95, WD 2 mm). Una etapa piezoeléctrico de bucle cerrado realiza desplazamientos axiales de hasta 400 m del objetivo. Tubos fotomultiplicadores recogen la señal de fluorescencia. </li><li> Anestesiar al animal, entonces la posición de la cabeza en el soporte estereotáctico para que la ventana craneal establece paralelo a la objetivaciónve plano focal. </li><li> Explore con TPF imágenes de la corteza bajo la ventana craneal. Elija el axón a dañarse entre los más brillantes. </li><li> Adquirir una pila Z (normalmente el campo de visión es de 100 x 100 m 2, en 512 x 512 píxeles, 2 micras paso del eje z) para obtener un 3D reconstrucciones del axón apuntado. Dentro del volumen reflejado, elegir el lugar de la lesión axonal en una rama que se encuentra principalmente en paralelo al plano focal. Esta orientación permite marcar rápidamente los cambios morfológicos, que son predictivos de una disección de éxito. </li><li> Irradiar con una alta dosis de energía el punto seleccionado en una porción distal de un CF. Esto se realiza a través del software Labview: aumentar la potencia del láser 5-10x más que el poder utiliza para la imagen (≈ 300 mW, medida después de la lente del objetivo), ajuste la posición de los espejos galvanométricos para hacer una exploración de línea (~ 4 - 10 micras) en el sitio de la lesión y abrir el obturador de láser para: 400 - 600 mseg. Orientar la exploración de líneaperpendicular al plano de CF a seccionar completamente el axón. La irradiación de los puntos más brillantes (por ejemplo., Varices) generalmente ayuda a la disección del axón. La longitud de onda para la axotomía láser es el mismo utilizado para la formación de imágenes (920 nm). </li><li> Por lo general, la fluorescencia del axón en el área irradiada disminuye transitoriamente debido a photobleaching. Adquirir una pila de la misma región pocos minutos después de la irradiación para garantizar la ablación ha sido bien realizado. Si la región se inició la hinchazón y el axón formó estructuras en forma de cuentas, la neurona se ha diseccionado con éxito. En este caso, en unas pocas horas (desde pocas decenas de minutos a 24 horas) la porción distal del axón se degenerar y desaparecer por completo. </li><li> Desafortunadamente la dosis de energía necesaria para producir una axotomía completa no siempre es predecible. Si el único resultado de la irradiación se photobleaching, la fluorescencia debe ser recuperado rápidamente debido a la difusión del colorante, y la irradiación debe repetirse de nuevo para efectivaly diseccionar el axón. También, en caso de signos de inflamación no aparecen dentro de 5 a 20 minutos, o la hinchazón va seguido de recuperación (. Forma análoga a lo que se ha descrito para dendrotomy láser, ver Allegra Mascaró et al 23), intente de nuevo con nuevas exploraciones aumentar el tiempo de permanencia y / o la potencia del láser. </li><li> Monitorear la eventual remodelación del axón en los días que siguen a la axotomía láser con dos fotones de imágenes in vivo (Figuras 2 y 3). El patrón vascular se utiliza como patrón de referencia para recuperar el axón diseccionado en los siguientes días. </li><li> Por vía subcutánea administrar carprofeno (5 mg / kg) de cada sesión de formación de imágenes para toda la duración del experimento. </li></ol>

<ol>
	<li>Strata, P., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+olivocerebellar+pathway.">Plasticity of the olivocerebellar pathway.</a> Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).</li><li>Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reparative+mechanisms+in+the+cerebellar+cortex.">Reparative mechanisms in the cerebellar cortex.</a> Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).</li><li>Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Sacconi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).</li><li>Allegra Mascaro, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single+branch+axotomy+induces+GAP-43-dependent+sprouting+and+synaptic+remodeling+in+cerebellar+cortex.">In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).</li><li>Ylera, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronically+CNS-injured+adult+sensory+neurons+gain+regenerative+competence+upon+a+lesion+of+their+peripheral+axon.">Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon.</a> Curr Biol. 19, 930-936 (2009).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+single+neuron+axotomy+triggers+axon+regeneration+to+restore+synaptic+density+in+specific+cortical+circuits.">In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits.</a> Nat Commun. 4, 2038 (2013).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+elimination+and+protection+after+minimal+injury+depend+on+cell+type+and+their+prelesion+structural+dynamics+in+the+adult+cerebral+cortex.">Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex.</a> J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .</li><li>Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+and+regeneration+a+mechanistic+tug+of+war.">Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war.</a> J Neurochem. 108, 23-32 (2009).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Luo, L., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+retraction+and+degeneration+in+development+and+disease.">Axon retraction and degeneration in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).</li><li>Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanycytes+present+in+the+adult+rat+mediobasal+hypothalamus+support+the+regeneration+of+monoaminergic+axons.">Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons.</a> Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).</li><li>Morrison, E. E., Costanzo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+olfactory+sensory+neurons+and+reconnection+in+the+aging+hamster+central+nervous+system.">Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system.</a> Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).</li><li>Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+therapeutics+regeneration+or+sprouting+or+plasticity.">Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity.</a> Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Two-Photon+Excitation+Microscopy+and+Its+Applications+to+Neuroscience.">Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptors+regulate+dynamic+equilibrium+of+presynaptic+terminals+in+mature+hippocampal+networks.">AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks.</a> Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li><li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex.">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49, 861-875 (2006).</li><li>Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+nanosurgery+in+live+brain.">Multi-photon nanosurgery in live brain.</a> Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).</li><li>Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+climbing+fibres+surviving+a+subtotal+lesion+of+the+inferior+olive+in+the+adult+rat.+II.+Synaptic+organization+on+reinnervated+Purkinje+cells.">Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells.</a> The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).</li><li>Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reparative+mechanisms+in+the+cerebellar+cortex.">Reparative mechanisms in the cerebellar cortex.</a> Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).</li><li>Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sprouting+and+axonal+atrophy+in+cerebellar+climbing+fibres+following+in+vivo+silencing+of+the+growth-associated+protein+GAP-43.">Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43.</a> PLoS One. 6, e20791 (2011).</li><li>Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+motility+and+its+modulation+by+activity+are+branch-type+specific+in+the+intact+adult+cerebellum.">Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum.</a> Neuron. 56, 472-487 (2007).</li><li>Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entire+trajectory+of+single+climbing+and+mossy+fibers+in+the+cerebellar+nuclei+and+cortex.">The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex.</a> Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).</li><li>Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+trophic+interactions+between+climbing+fibres+and+Purkinje+cells+in+the+rat+cerebellum.">Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum.</a> Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. (12), (2008).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Este protocolo muestra cómo etiquetar las neuronas de la oliva inferior con un colorante fluorescente. Posteriormente, el método para llevar a cabo una ventana craneal en la corteza cerebelosa se describe. Esta técnica proporciona acceso óptico a la parte terminal de las neuronas olivocerebellar, las fibras de escalada. Por desgracia, el resultado de tanto el etiquetado y la cirugía craneotomía es bastante bajo, incluso en manos de operadores calificados (por lo general 1 de cada 3 ratones se etiqueta, y 1 de cada...

Transección axonal que resulta de una lesión mecánica, agresión tóxica o las enfermedades neurodegenerativas es generalmente seguido por la degeneración de la parte distal del axón que se separa del cuerpo celular 10-13. Con unas pocas excepciones 2,7,14,15, axones dañados en el SNC de animales adultos son generalmente incapaces de activar un programa de recrecimiento 16. Poco se sabe acerca de la dinámica en tiempo real de eventos degenerativos a nivel celular y subcelular. El desarrollo de nuevas estrategias para limitar el daño neuronal y promover el nuevo crecimiento neuronal requiere, como primer paso, aclarar el mecanismo por el cual las células neuronales singularmente lesionados degeneran y se regeneran. Este estudio se dirige más directamente mediante el control de la dinámica de una sola neurona in vivo. Mientras que las técnicas de imagen de fluorescencia de un fotón están limitados por una intensa dispersión de la luz visible, la excitación de dos fotones alcanza profundas capas corticales en lihe ratones con resolución subcelular 3,4,17. Tomando ventaja de los ratones transgénicos en los que las proteínas fluorescentes se expresan selectivamente en subpoblaciones de neuronas 18-20, microscopía de TPF ha sido aplicada a la exploración de la plasticidad sináptica y la elongación axonal durante el desarrollo in vivo 21,22. L a la capacidad de las neuronas dañadas singularmente a volver a crecer después de la lesión puede ser investigado por el acoplamiento en el seguimiento in vivo de dos fotones de imágenes con un modelo de lesión dirigida específicamente al axón de interés. Absorción multi-fotón de pulsos de femtosegundos se ha utilizado para interrumpir dendritas individuales o incluso espinas individuales 5,23. Por otra parte, este paradigma lesión permite cortar ramas axonales individuales sin interrumpir la dendrita de contactos 6. En el contexto de la disección de las características que permiten a la población neuronal específica de regenerar sus axones vez dañadas, las fibras trepadoras del cerebelo (SFC) son un modelo útil sina vez que retienen propiedades plásticas notables después de la lesión, incluso en los animales adultos 24,25. Recientemente, proyección de imagen a largo plazo de las FC mostró que estos axones son capaces de recrecimiento en los días que siguen a la axotomía láser 6. Este protocolo describe cómo etiquetar las neuronas olivocerebellar y su elongación axonal a través de rastreo anterógrada. Una vez que las neuronas de interés están marcados con fluorescencia, que se pueden monitorizar varias veces en los puntos de tiempo arbitrarios para semanas o meses en virtud de una ventana craneal. El procedimiento para diseccionar ramas axonales individuales por axotomía láser in vivo A continuación, se ilustra. Las técnicas presentadas aquí proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos de remodelación axonal in vivo y pueden ayudar al desarrollo de estrategias terapéuticas para limitar la degeneración neuronal y promover la regeneración axonal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab standard stereotaxic, rat and mouse</td>
			<td>Stoelting&#160;</td>
			<td>51670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 (Glass bead sterilizer)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection dispense system</td>
			<td>Picospritzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>64-0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses,&#160; 90 MHz repetition rate</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spongostan, haemostatic sponge&#160;</td>
			<td>Ferrosan</td>
			<td>MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirrors&#160;</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective&#160;</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric stage&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier modules&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>H7710-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW System Design Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate)</td>
			<td>Boheringer Ingelheim</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rymadil (carprofen)&#160;</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine clorohydrate 2%</td>
			<td>ATI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 dextran</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser nanosurgery of cerebellar axons in vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Este protocolo describe cómo llevar a cabo el etiquetado axonal, imágenes in vivo y axotomía láser en las neuronas individuales. La línea de tiempo del experimento se muestra en la Figura 1. Un ejemplo de SFC marcada con Alexa Fluor 488 de dextrano y visualizados debajo de la ventana craneal por microscopía in vivo de dos fotones se informó en la Figura 2. Como se informó anteriormente 6,27, las ramas ascendentes muestran...

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Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Dos fotones de imágenes, acoplado a nanodissection láser, son herramientas útiles para el estudio de los procesos degenerativos y regenerativos en el sistema nervioso central con resolución subcelular. Este protocolo muestra cómo etiquetar, imagen y diseccionar las fibras individuales de escalada en la corteza cerebelosa in vivo.

Laser Nanocirugía del cerebelo Los axones<em&gt; En Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

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Neuroscience

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

8.1K vistas.  University of Florence.  Dos fotones de imágenes, acoplado a nanodissection láser, son herramientas útiles para el estudio de los procesos degenerativos y regenerativos en el sistema nervioso central con resolución subcelular. Este protocolo muestra cómo etiquetar, imagen y diseccionar las fibras individuales de escalada en la corteza cerebelosa in vivo. 