Este protocolo es un método simple para cuantificar la eficiencia con la que diferentes cepas y especies de levaduras se aparean entre sí. El método propuesto es simple, robusto y eficiente. El método se puede extender a cualquier cepa de levadura.
El método descrito en este estudio se puede utilizar para comprender cómo se produce la especiación en la levadura. Además, las cepas que describimos pueden ser particularmente útiles para diseñar experimentos con el flujo de genes. La fuerza del método es que es realmente simple.
Algunos ajustes leves, como el tiempo de incubación, pueden ser necesarios dependiendo de la cepa particular utilizada. Comience a revivir los haploides A y Alfa de las existencias congeladas rayando el inóculo de levadura en una placa de agar peptona dextrosa de extracto de levadura, o placa de agar YPD. Permítales crecer durante 48 horas a 30 grados centígrados para obtener colonias individuales.
Después de la incubación, inocular colonias individuales de la placa YPD y cinco mililitros de YPD medio, e incubar a 30 grados centígrados durante 48 horas con agitación de 250 RPM. Las células están en la fase estacionaria de crecimiento después de este período de incubación. En una placa YPD nueva, dibuje la rejilla de eficiencia de acoplamiento como un rectángulo de 1 por 1,5 centímetros dividido en tres cajas, cada una con una dimensión de 1 por 0,5 centímetros.
Inocular cinco microlitros del cultivo YPD de los dos tipos de apareamiento en los rectángulos más a la izquierda y a la derecha. Este volumen corresponde aproximadamente 5 veces 10 a la quinta célula haploide en cada sección. Incubar las placas durante 24 horas a 30 grados centígrados.
Para mezclar un número igual de células de levadura, retire aproximadamente 1/3 del crecimiento de levadura desarrollado en las cajas exteriores utilizando un palillo estéril y resuspenda las células eliminadas en 20 microlitros de agua en un vial estéril de 1,5 mililitros. Siga esto para cada haploide. Luego, diluya cinco microlitros de esta suspensión en dos mililitros de agua y mida la densidad óptica usando un espectrofotómetro a 600 nanómetros.
Según el valor de densidad óptica y el número de células por mililitro a una densidad óptica, agregue los volúmenes requeridos de ambos haploides en un vial fresco y estéril de 1,5 mililitros. Mezclar bien con una pipeta. El volumen final de esta suspensión es generalmente de alrededor de seis a ocho microlitros.
A continuación, inocula esta suspensión en la rejilla central. Incubar la placa a 30 grados centígrados durante siete horas, permitiendo que los haploides se apareen. Después de siete horas de incubación, raspe las células del rectángulo central con un palillo de dientes o una punta de pipeta y diluya en dos mililitros de agua estéril.
Llevar a cabo diluciones adicionales, y luego extender la suspensión celular en agar YPD para obtener colonias individuales. Después del emplatado, incubar las placas YPD a 30 grados centígrados durante 36 a 48 horas para desarrollar colonias individuales. Asegúrese de que se obtengan unos pocos cientos de colonias individuales de cada experimento de apareamiento para la detección para garantizar la significación estadística de los datos.
Para identificar las colonias diploides en la placa, transfiera las colonias individuales rayándolas individualmente en una placa de doble caída, careciendo de los aminoácidos para los que las cepas son auxotróficas. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 horas y calcular la eficiencia de apareamiento, nu. La robustez del protocolo permitió una fácil diferenciación de la eficiencia de acoplamiento entre las dos cepas, SK1AM y ScAM.
Mientras que las cepas SK1 se acoplaron con una eficiencia muy alta, las cepas ScAM se acoplaron con una eficiencia relativamente menor. La eficiencia de apareamiento de las cepas ScAM disminuyó significativamente cuando el ambiente no contenía glucosa como fuente primaria de carbono, lo que indica que el apareamiento es un proceso energéticamente costoso y el crecimiento en fuentes alternativas de carbono reduce cualitativamente la eficiencia del apareamiento. Cuando se les permitió aparearse durante diferentes períodos de tiempo, no se observó apareamiento durante las primeras cuatro a cinco horas.
Los primeros diploides aparecieron solo después de cuatro a cinco horas, lo que indica que este es el tiempo necesario para que el proceso de apareamiento se complete en el entorno dado. Después de eso, la eficiencia de apareamiento aumentó rápidamente. Más allá de siete horas, los cálculos de eficiencia de apareamiento fueron influenciados por el hecho de que el crecimiento mitótico comenzó en la placa.
Asegúrese de que se mezcle el mismo número de ambos haploides. Las desviaciones de esto conducirían a variaciones en las repeticiones independientes del protocolo. Cómo el flujo genético afecta la adaptación y la especiación es una pregunta abierta.
Dado que los marcadores auxotrofos se insertan junto al locus MAT en nuestras cepas, esto ayuda a abordar esta importante pregunta.
