Este trabajo fue apoyado por el Consejo Australiano de Investigación subvención DP0986937.

Selección de cepas de levadura de control adecuado El ensayo se basa en el experimentador evaluar visualmente la acumulación de fluorescencia de color rojo en la vacuola de levadura. Como tal, el ensayo es subjetiva y se basa en la selección de cepas de control adecuadas y las condiciones de crecimiento. Un control de tipo salvaje se utiliza para indicar los niveles de autofagia que normalmente se espera. Como control negativo un nulo esfuerzo para la expresión de uno de los principales genes autofagia (por ejemplo, ATG3) es adecuado, estas cepas no se puede entregar el material (por ejemplo, las mitocondrias, núcleo) a la vacuola 1. Transformación de células de levadura con el plásmido de ADN Las células de levadura se puede hacer fácilmente aptas para la transformación mediante el tratamiento con LiAcetate. Kits comerciales pueden ser comprados (por ejemplo, Easycomp, Invitrogen) y los protocolos publicados están disponibles 13. En este protocolo se utiliza cepa de tipo salvaje BY4741 (MAT un his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), y algunos miembros de una completa biblioteca de supresión cepas mutantes (por ejemplo, Δ atg3) que se derivan de ella, cada expresión de falta de otro gen no esencial. La biblioteca supresión cepa representa una herramienta valiosa para la investigación de la autofagia con Rosella basada en sondeos. El reportero de empleados en este protocolo es mt-Rosella de las mitocondrias (Fig. 2A), codificada por pAS1NB: mt-Rosella 12. Los siguientes pasos se basan en el uso de células hechas competente mediante el kit de transformación Easycomp y almacenado congelado a -80 ° C para facilitar su uso. <ol><li> Equilibre la solución III (Easycomp transformación Kit) a temperatura ambiente 30 minutos antes de añadir a las células de levadura. </li><li> Añadir 2-2,5 l (~ 100 ng / l) de ADN de plásmido que codifica la periodista (pAS1NB: mt-Rosella) a un estéril 1,7 ml con tapa de tubo de microcentrífuga de plástico. </li><li> Añadir 5 l de la suspensión recién descongelado de células de levadura y mezclar competente mediante pipeteo suave. </li><li> Añadir 50 l de solución III (Easycomp transformación Kit) y agitar para mezclar. 1.5) Se incuban las reacciones de transformación durante 1 hora a 28-30 ° C con una mezcla vigorosa cada 15 minutos usando un mezclador de vórtice o manualmente accionando el tubo con el dedo. </li><li> Transferir cuidadosamente la mezcla de transformación en una sola placa de agar YMM crecimiento suplementado con histidina, metionina y uracilo, y suavemente distribuir las células alrededor de la superficie del agar con un esparcidor de vidrio estéril. Las células de levadura son frágiles en esta etapa y un manejo suave puede aumentar el rendimiento de los transformantes. </li><li> Incubar las placas de crecimiento de 2 a 4 días a 28-30 ° C o hasta que las colonias aparecen unos 2-3 mm de diámetro. </li></ol> 2. Confirmando la expresión de Rosella en células de levadura Antes de embarcarse en experimentos detallados de la correcta localización y la expresión eficiente de Rosella debe ser confirmado. <ol><li> Con mondadientes estéril seleccionar para cada cepa 5 colonias aisladas de la placa de la transformación y suspender las células en 50 l de agua estéril en esterilizada 1,7 ml con tapa de tubo de microcentrífuga de plástico. </li><li> Lugar 10 l de cada suspensión celular en la etiqueta por separado portaobjetos de vidrio (76 x 26 mm) y la tapa de la suspensión celular con una plaza cubreobjetos (22 x 22 mm). </li><li> Inmediatamente examinar las células para la emisión de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia (por ejemplo, Olympus Fluoview FV500). Busque fuerte fluorescencia verde y el rojo y el etiquetado típico de localización mitocondrial (Fig. 2B y 2C). </li><li> El resto de cada colonia examinados por fluorescencia de esta manera deben ser inoculadas en un plato YMM de cultivo fresco. </li><li> Incubar las placas a 28-30 º C durante 2 días hasta que la colonia es de aproximadamente 3.2 mm de diámetro. </li></ol> 3. Crecimiento celular y la inducción de la autofagia La autofagia puede ser inducida mediante un número de diferentes condiciones experimentales, incluida la entrada en fase estacionaria, cambio de fuente de carbono, la administración de rapamicina, o de hambre de nitrógeno. Nosotros usamos el hambre de nitrógeno como el método para inducir mitophagy. <ol><li> Inocular una colonia en 10 ml de medio de cultivo que contienen el etanol y los suplementos auxotróficos apropiado. </li><li> Incubar los cultivos de levaduras a 28-30 ° C con agitación orbital (200 rpm) durante aproximadamente 48 horas. Las células deben estar en fase de crecimiento a mediados de registro. </li><li> Pellet de células muestras duplicadas de 1 ml de la cultura en estéril 1,7 ml tapa snap-tubos de plástico de la centrifugadora por centrifugación a 2.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. Con cuidado, retirar y desechar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular. </li><li> Se lavan las células tres veces con 1 ml de agua destilada estéril por resuspensión y centrifugación para eliminar m residualedium. </li><li> Después del tercer lavado resuspender las células en 100 ml de medio de cultivo o medio de nitrógeno hambre. </li><li> Volver a inocular las células se resuspendieron en 10 ml de medio de cultivo fresco o 10 ml de medio de nitrógeno hambre. Incubar con agitación orbital durante 6-12 horas para permitir la inducción de la mitophagy. Después de hambre preparar las células para su visualización por microscopía de fluorescencia. </li></ol> Nota: El etiquetado de la vacuola con CMAC-Arg La primera vez que se establece el ensayo es útil para confirmar la entrega bajo microscopio de fluorescencia de Rosella a la vacuola. A pesar de la vacuola de levadura es un orgánulo grande cuya ubicación a menudo pueden ser fácilmente determinadas por referencia a las imágenes de luz transmitida, en algunas cepas de la levadura y bajo ciertas condiciones de crecimiento de la vacuola puede ser fragmentado y difícil de localizar. La vacuola puede ser fácilmente etiquetados con un tinte vacuolas cumarina basado, como CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, L-arginina amida). La acción de las proteasas vacuolares en los resultados de colorante en el etiquetado fluorescencia azul brillante de la vacuola. La emisión de color azul se pueden distinguir fácilmente de las emisiones de rojo y verde de Rosella 11. Etiquetado con la CMAC-Arg no tiene que ser realizada de forma rutinaria, pero se recomienda para aquellos que no están familiarizados con la ubicación y el aspecto de la vacuola en la levadura. 4. Etiquetado de la vacuola con CMAC-Arg <ol><li> Añadir la CMAC-Arg (100 mM concentración final) a las células que crecen o se le priva de nitrógeno antes de la imagen. La solución CMAC-Arg puede ser preparado de antemano, pero a medida que la solución es sensible a la luz que necesita ser protegido de la exposición a la luz. </li><li> Incubar a 28-30 ° C con agitación orbital (200 rpm) durante 30 minutos. </li><li> Pellet células por centrifugación a 2.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Se lavan las células tres veces con agua destilada estéril por resuspensión y centrifugación para eliminar medio residual y el exceso de tinte CMAC-Arg. </li><li> Montaje de las células para obtener imágenes como se describe a continuación. </li></ol> 5. Montaje de las células vivas de la levadura para la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) <ol><li> Derrita 2 mg de bajo punto de fusión de agarosa por separado en alícuotas de 1 ml de medio de cultivo y medio de nitrógeno hambre mediante la incubación a 70 ° C. La agarosa fundida se mantiene a 70 ° C. </li><li> Suavemente que sedimenten las células en alícuotas de 1 ml de cada cultivo de células por centrifugación a 2.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. </li><li> Se lavan las células tres veces con 1 ml de agua destilada estéril por resuspensión y centrifugación como en el paso 5.2. </li><li> Resuspender las células se lavan en 100 l de agua destilada estéril. </li><li> Para montar el lugar las células 20 l de agarosa fundida en un portaobjetos de microscopio de vidrio etiquetados (76 x 26 mm). </li><li> Inmediatamente punto 10 l de la suspensión de células lavadas en la cama de agarosa. </li><li> Cubra la cama de agarosa con un cubreobjetos (22 x 22 mm). Las células se extenderá por toda la superficie de agarosa bajo el cubreobjetos. </li><li> Para prevenir la deshidratación y el movimiento del cubreobjetos durante la exploración Selle cuidadosamente los bordes de los portaobjetos con una fina capa de esmalte de uñas. </li><li> Cuando el esmalte esté completamente seco (10 min) de la diapositiva está listo para ver por Cuidado con microscopía de fluorescencia: esmalte de uñas puede causar daño a los objetivos de microscopio. </li><li> Células montado con esta técnica se pueden observar hasta 1 hora después del montaje. </li></ol> 6. Autofagia visualizar utilizando CLSM El nivel de la autofagia en una población de células se evalúan regularmente mediante la determinación del número de células que presentan una fluorescencia de color rojo vacuolar antes y después de la inducción de la autofagia. Lo ideal sería que la progresión de la autofagia es un control en los puntos de tiempo seleccionado después de la inducción de la autofagia (Fig. 3). Esto se realiza mejor mediante la visualización a través del binocular microscopio. Es importante que los controles adecuados se utilizan (por ejemplo, Δ atg3 mutante) y que los valores permanecen sin cambios entre el microscopio de la observación de diferentes muestras (por ejemplo, el uso de filtros de densidad neutra, la selección de filtro). Las células de levadura son relativamente pequeñas que requieren de un microscopio de fluorescencia buena calidad (por ejemplo, Olympus Fluoview FV500) equipados con filtros de excitación / emisión adecuado para la visualización por separado de las buenas prácticas agrarias y / o pHluorin (fluorescencia verde de emisión) (FITC filtro) y DsRed.T3 (rojo emisión de fluorescencia) (TRITC filtro). <ol><li> El uso de un punto de vista objetivo 60x de agua no las células privadas de tipo salvaje utilizando alternativamente los filtros FITC y TRITC. Las células de tipo salvaje debe exhibir una distribución típica de las mitocondrias celulares en la periferia de las células que muestran tanto la fluorescencia de color rojo y verde. Tenga en cuenta que esta distribución de las mitocondrias es dependiente de la Pinhestablecimiento ole del microscopio confocal. Por lo general, utilizar un valor inferior del agujero de alfiler de 125 micras que sólo permite la mitocondria para ser observado como una serie de puntos localizados en la periferia de la célula (Fig. 2C) para que la vacuola no está oculto 12. Si un valor alto de agujero de alfiler (200 m) se utiliza esto permite que la típica red mitocondrial filamentosas distribuidas por toda la célula (y los cambios que experimenta) para ser observado 11. No hay otras estructuras de la célula debe ser marcado con fluorescencia. </li><li> Secuencialmente ver las células de cada uno de los puntos de tiempo después de la transferencia a medio morir de hambre. Visualizar alternativamente usando los filtros de emisión verde y rojo. A las 6 h de hambre el tiempo de fluorescencia punto rojo, pero no hay emisión verde correspondiente debe ser perceptible en la vacuola. Localización vacuolar puede confirmaron por separado con CMAC-Arg (Fig. 2C). Ver ~ 200 células y contar el número que sólo muestran fluorescencia de color rojo en la vacuola (es decir, la captación vacuolar de las mitocondrias). </li><li> Contar con la acumulación vacuolar de todos los puntos de tiempo de observación&gt; 200 células y el porcentaje de células que muestran trama acumulación vacuolar. </li><li> Examine la autofagia-negativas control de las células que expresan mt-Rosella antes de la inanición y el hambre después de seis horas. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Aquí, mostramos los resultados típicos obtenidos con mt-Rosella, expresada en el tipo salvaje y Δatg3 células mutantes. Bajo condiciones de cultivo con etanol como fuente de carbono, tanto de tipo salvaje y Δatg3 células mutantes muestran una distribución celular de la fluorescencia (rojo y verde) típica de las mitocondrias en células de levadura. Roja y de emisión de fluorescencia de color verde no se detecta en la vacuola (Fig. 2B y 2C). Al ser sometido al hambre de nitrógeno durante 6 horas y luego más allá, además de fluorescencia de color rojo y verde que corresponde a las mitocondrias, las células de tipo salvaje también muestran la acumulación de rojo, pero no la fluorescencia verde en el lumen vacuolar (Fig. 2B;. Fig. 3) . Sin embargo, en las células mutantes Δatg3 fluorescencia ni rojo ni verde, se acumula en el lumen vacuolar (Fig. 2C;. Fig. 3). <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Arriba, el esquema de los orgánulos y compartimentos de una célula de levadura. En pocas palabras, una visión centrada en la vacuola de una célula de levadura se presenta lo que indica la degradación de la autofagia diferentes orgánulos y compartimentos. Algunas de las diferencias entre los distintos orgánulos específicos de los tipos de autofagia (por ejemplo, mitophagy, nucleophagy) incluir la especificidad (la selección de carga) de los contenidos envuelto, varias necesidades intracelulares y señales extracelulares (por ejemplo, el hambre, el daño), señales específicas, ATG genes y la dependencia del tiempo. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Figura 2a" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Figura 2b" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Figura 2c" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Figura 2d" /> Figura 2. (A) Representación esquemática de mt-Rosella. La secuencia líder mitocondrial (en este caso de la citrato sintasa) se utiliza para apuntar el biosensor Rosella a la matriz mitocondrial. Excitación y emisión máximos, tanto para la proteína roja fluorescente (DsRed.T3) y la proteína verde fluorescente (pHluorin) se indican. A pH alto (pH ~ 8.2 mitocondrial) el biosensor fluorescencia roja y verde, sin embargo, a pH bajo (pH vacuolar ~ 5.5) que emite fluorescencia solamente el rojo. (B) Representación esquemática de los resultados esperados en el tipo salvaje y Δ atg3 células mutantes que expresan mt-Rosella. (C) Los resultados reales obtenidos por CLSM de células de tipo salvaje en cultivo y las condiciones de nitrógeno hambre. De izquierda a derecha:. DIC (diferencia de contraste), PP (DsRed.T3) emisión fluorescente, GFP (pHluorin) de fluorescencia de emisión, CMAC-Arg fluorescencia y la imagen de fusión (D) Los resultados reales obtenidos por microscopía de fluorescencia de células mutantes en Datg3 crecimiento y las condiciones de nitrógeno hambre. De izquierda a derecha: DIC (diferencia de contraste), PP (DsRed.T3) emisión fluorescente, GFP (pHluorin) de fluorescencia de emisión, CMAC-Arg fluorescencia y la imagen de fusión. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. El porcentaje de tipo salvaje y mutante Δ células atg3, expresando mt-Rosella y cultivados en el hambre de nitrógeno, que presentan una fluorescencia de color rojo en la vacuola durante un curso de 48 horas. El porcentaje de células que muestran la acumulación de fluorescencia de color rojo en la vacuola se registró a las 0, 6, 12, 24 y 48 horas después de comenzar el hambre de nitrógeno.

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En las imágenes representativas se presentan en la figura. 2B y 2C que se puede ver claramente que el uso de orgánulos específicos de los periodistas fluorescentes y microscopía de fluorescencia proporciona evidencia de localización mitocondrial / distribución, tanto en crecimiento y las células de hambre de nitrógeno, y permite mitophagy para ser visualizados. Es de destacar que este método no se limita a mitophagy siguiente. Autofagia de otros componentes celulares u orgánulos (por ejemplo, los ribosomas, las gotas de lípidos, peroxisomas, retículo endoplasmático y el núcleo) puede ser controlado con un etiquetado adecuado. Detalles de la construcción de biosensores Rosella, condiciones de cultivo celular y los resultados típicos de rotación del núcleo (nucleophagy) han sido reportados 11,12 ilustra la aplicación más amplia del método. El uso de orgánulos específicos de los periodistas fluorescentes de la autofagia monitoreo requiere varias consideraciones de diseño para la construcción de tenerse en cuenta. Estos incluyen: (1) la selección y la fusión con la señal de la adecuada focalización de lograr orgánulos específicos de selección; (2) la selección de una proteína fluorescente adecuada (s), (3) emisión de fluorescencia fuerte, (4) correcta localización de orgánulos y / o distribución dentro de la célula. Una vez que el reportero de orgánulos específicos se ha expresado con éxito en la cepa huésped de levadura elegido un segundo grupo de consideraciones se convierten en: (1) las condiciones de crecimiento de la levadura, (2) la preparación de muestras de células, (3) imágenes de los parámetros, ya que es importante que los parámetros seleccionados para CLSM (por ejemplo, la intensidad del láser, frecuencia y modo, el valor del agujero de alfiler, el valor de zoom, los objetivos utilizados o la exposición de la cámara CCD) se mantienen a lo largo de un experimento asegurarse de que se pueden hacer comparaciones entre el control (células de crecimiento) y las muestras de hambre; ( 3) la inducción de la autofagia y exitosa entrega de la periodista en la vacuola. En general, este método de microscopía de fluorescencia es fácil y relativamente rápido, y tiene una aplicación potencial para el cribado de alto rendimiento para los nuevos fármacos que facilitan o inhiben la autofagia, y también para los genes que regulan o modulan la autofagia.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae Easycomp transformación Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Levadura base de nitrógeno sin aminoácidos y sulfato de amonio </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Agarosa de bajo de fusión </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Portaobjetos de microscopio (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos microscopio (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> De escaneo láser confocal Microscopio Fluoview FV500 </td><td> Olimpo </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular sondas-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Todas las concentraciones que se dan son w / v, a menos que se indique lo contrario. Levadura medio mínimo (YMM): 0,67% base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, glucosa al 2%, 1,5% de agar (sólo añadió al hacer los medios de comunicación sólidos) y los suplementos necesarios auxotróficos (0,01%)]. Saccharomyces Sales (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0,12%; KH 2 PO 4, 0,10%; MgC1 2 0,6% H2O, 0,07; NaC1, 0.05%, CaCl2, 0,01%; FeC1 3, 0,0005%. Medio de crecimiento: SS y 2% de etanol (v / v) y suplementos apropiados auxotróficos. Nitrógeno hambre medio: 0,17% base nitrogenada de levadura sin aminoácidos y sulfato de amonio (Difco), 2% de etanol (v / v).

a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae

La autofagia es importante para el movimiento de los componentes celulares en un rango de condiciones diferentes. Cumple una función esencial homeostático, así como un mecanismo de control de calidad que pueden degradar selectivamente objetivo y material celular como organelles1-4. Por ejemplo, las mitocondrias dañadas o redundante (Fig. 1) no se eliminará la autofagia, puede representar una amenaza para la homeostasis celular y la supervivencia celular. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, la privación de nutrientes (por ejemplo, el hambre de nitrógeno) o el daño se puede promover la renovación selectiva de las mitocondrias de la autofagia en un proceso denominado mitophagy 5-9. Se describe un método simple microscopio de fluorescencia para evaluar la autofagia. Para mayor claridad, restringimos nuestra descripción aquí para ver cómo el método puede ser usado para monitorear mitophagy en células de levadura. El ensayo hace uso de un fluorescente reportero, Rosella, que es un biosensor de doble emisión que comprende un pH relativamente estable proteína fluorescente roja vinculado a un pH sensible a la proteína verde fluorescente. El funcionamiento de este periodista se basa en las diferencias de pH entre la vacuola (pH ~ 5.0 hasta 5.5) y mitocondrias (pH ~ 8,2) en las células vivas. Bajo condiciones de cultivo, las células de tipo salvaje muestran tanto la fluorescencia de color rojo y verde distribuido de una manera característica de las mitocondrias. Emisión de fluorescencia no se asocia con la vacuola. Al ser sometido al hambre de nitrógeno, una condición que induce mitophagy, además de fluorescencia de color rojo y verde etiquetado de las mitocondrias, células presentan la acumulación de rojo, pero no de fluorescencia verde, en el lumen vacuolar ácida que representa la entrega de las mitocondrias de la vacuola. Anotando las células con rojo, pero vacuolas fluorescente verde no puede ser utilizado como una medida de la actividad en las células mitophagic 5,10-12.

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A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Un enfoque sólido para controlar la entrega de los orgánulos de la luz del ácido de la vacuola de levadura para la degradación y el reciclaje se describe. El método se basa en el etiquetado específico de los orgánulos de destino con una codificada genéticamente doble emisión de fluorescencia de pH biosensor, y la visualización de las células individuales mediante microscopía de fluorescencia.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

a-fluorescence-microscopy-assay-for-monitoring-mitophagy-yeast

Research

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Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

25.3K vistas.  Monash University. Un enfoque sólido para controlar la entrega de los orgánulos de la luz del ácido de la vacuola de levadura para la degradación y el reciclaje se describe. El método se basa en el etiquetado específico de los orgánulos de destino con una codificada genéticamente doble emisión de fluorescencia de pH biosensor, y la visualización de las células individuales mediante microscopía de fluorescencia.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Investigación

Biología

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).