Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

1. Crecimiento de células de levadura <ol><li> Seleccionar las cepas de levadura adecuadas para ser utilizadas para las mediciones de tasa de descomposición de ARNm. Para inhibir la transcripción usando el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II, utilizar cepas de levadura que albergan la mutación rpb1-1 1. Obtener esta cepa de levadura de un laboratorio que ya tiene uno, o generar en el laboratorio usando técnicas convencionales si se requiere un fondo genético específico 9. </li><li> Utilizando una técnica estéril, preparar los medios de levadura utilizando procedimientos estándar 10. Si no se requiere la selección, preparación de medios ricos tales como YPD. Alternativamente, se preparan medios selectivos si se requiere las células de levadura se transforman con plásmidos y selección. Autoclave los medios de comunicación. </li><li> Cultivar las células de levadura a 28 ° C, que es la temperatura permisiva para esta cepa de levadura. Haced esto en dos pasos: <ol><li> Por primera O / N, crecen las células de levadura en 5 ml de medio de cultivo a la saturación.</li><li> Configure la segunda O / N al final del segundo día. Para el segundo O / N, inocular diferentes cantidades de células de levadura de la primera O / N en 100 a 150 ml de medio de crecimiento (que van desde 100 l a 1 ml, 2 ml o más, dependiendo de cuando las células de levadura tienen que estar cosechado el día siguiente). Haga este paso para asegurarse de que una de las culturas es la correcta OD 600 al día siguiente. </li></ol></li></ol> 2. Recoger las células de levadura <ol><li> Prepárese para cosechar las células de levadura. El momento para esta etapa es crítica; etiquetar todos los tubos necesarios y reunir todos los equipos y materiales necesarios en un solo lugar. Precaliente un baño de agua a 39 ° C y precalentar dos 15 ml tubos de ensayo de los medios de crecimiento a 28 ° C y 60 ° C. NOTA: El volumen de medio de 15 ml de crecimiento se puede variar en función del número de puntos de tiempo las células son para ser cosechado. </li><li> Recoger las células de levadura cuando llegan a una DO 600 de 0,4 a 0,7. Transfer las células a 4 - 6 ml estériles tornillo 50 botellas de capitalización. Centrifugar a 7500 xg en una centrífuga de alta velocidad durante 5 min a RT. </li><li> Descartar el sobrenadante y volver a suspender las pastillas en los medios de cultivo de 15 ml que fue equilibrando a 28 ° C. Reunir las células de levadura en un matraz de 250 ml estéril y equilibrar ellos durante ~ 5 min a la temperatura de crecimiento de 28 ° C. </li><li> Después de que las células de levadura han equilibrado a la temperatura de crecimiento, añadir inmediatamente a los 15 ml de medio de crecimiento equilibrado a 60 ° C para elevar la temperatura a 39 ° C (la temperatura no permisiva) e inmediatamente colocar el matraz en el baño de agua 39 ° C . Asegúrese de que el medio de cultivo se mantiene en el 39 ° C baño de agua a través de los pasos de la recolección de células restantes para asegurarse de que la transcripción está apagado. </li><li> Recoger las células en diferentes momentos después de colocar el frasco en el 39 ° C baño de agua. Para el primer punto del tiempo, recoger las células inmediatamente después de colocar el matraz a 39 &amp; #176; C. Cosecha de una alícuota de 3 ml y distribuir el 3 ml en dos, de 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Sedimentar las células durante 10 segundos en una mini centrífuga o picofuge con desaceleración rápida y vierte el sobrenadante. </li><li> Congelar inmediatamente el pellet en un baño de hielo seco / etanol o en nitrógeno líquido. Designar el primer punto de tiempo, las células se cosechan en como el punto de tiempo cero. </li><li> Experimentalmente determinar los puntos de tiempo las células se cosecharon a partir de entonces por un experimento piloto, en función de los mRNAs de interés. Normalmente, las células de la cosecha de la levadura en los siguientes puntos de tiempo: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 y 35 min (Figura 2B). Si la vida media de mRNA no puede ser determinada usando los puntos de tiempo mencionados anteriormente, ajustar estos puntos de tiempo. Por ejemplo, para los ARNm con vidas medias cortas previstos, usar tiempos más cortos de puntos, (es decir, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 y 18 min) y para los ARNm con largas vidas medias previstos, extender los puntos de tiempo. </li><li> Después las células se harvested, guárdelos en un congelador a -80ºC hasta la extracción de RNA se llevó a cabo. </li></ol> 3. Extraer el ARN de las células de levadura <ol><li> Para la parte de extracción de RNA del protocolo, utilizar técnicas de RNasa libres para evitar la degradación del ARN por RNasas. Preparar RNasa soluciones gratuitas, cristalería y artículos de plástico que se utilizan en la extracción del ARN. </li><li> Extraer el ARN de las células de levadura de acuerdo con protocolos estándar. Normalmente, utilice el método de fenol caliente 12. Alternativamente, utilizar kits que se pueden utilizar para extraer el ARN a partir de células de levadura. </li><li> Determinar la cantidad y pureza del ARN, normalmente mediante la medición de la absorbancia a A 260 y A 280 de 2 l de ARN usando un Nanodrop. Determinar la concentración del ARN a partir de la A 260. Sobre la base de la concentración, diluir el RNA a 1 g / l usando agua tratada con DEPC. NOTA: La relación de la A 260 / A 280 proporciona información sobre tque la pureza del ARN. Una muestra de ARN es puro si la relación A260 / A280 es de 2,0 ± 0,1. </li></ol> 4. análisis de transferencia Northern NOTA: Utilice transferencias Northern para cuantificar los niveles de ARNm y obtener información sobre el tamaño de las transcripciones. Además, utilice transferencias Northern para detectar ARNm que producen múltiples isoformas del mismo ARNm. <ol><li> Preparar un gel de agarosa al 1,0%-formaldehído. Ejecutar cantidades iguales de la muestra de ARN en el gel de agarosa por electroforesis en formaldehído de acuerdo con protocolos estándar 12. Ejecutar una escalera ARN junto con las muestras de ARN y lo utilizan para determinar los tamaños de los ARN que se detectan en el norte de mancha. Antes de transferir el ARN separados en el gel de agarosa formaldehído a una membrana, cortar el carril con la escalera de ARN a partir del gel y visualizar usando bromuro de etidio. NOTA: Como alternativa, todo el gel se puede teñir con bromuro de etidio antes de la transferencia del ARN. </li><li> Laespués de la muestras de ARN han migrado a una distancia apropiada en el gel, transferir el ARN a una membrana usando RNasa técnicas libres. Utilice uno de los varios protocolos disponibles para transferir ARN a membranas de 12-13. Para transferir el ARN a una membrana, cortar la membrana a aproximadamente el mismo tamaño que el gel. Transferir el ARN de acuerdo con protocolos estándar 12. </li><li> UV reticular el ARN a la membrana utilizando un agente de reticulación UV siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, hornear la membrana en un horno a 80 ° C durante 1 hr. Almacenar la membrana a -20 ° C en una bolsa de plástico de forma indefinida hasta que se hibrida con sondas específicas. NOTA: La membrana seca también se puede almacenar a temperatura ambiente entre papeles de filtro. </li></ol> 5. hibridar sondas complementarias al ARN de interés para la Membrana NOTA: Una forma de detectar ARNm en la membrana es para hibridar 32 P sondas de ADN marcadas. PRECAUCIÓN: Researchers trabajan con 32 P necesitan utilizar procedimientos de protección para evitar la contaminación. Siga las directrices institucionales sobre el uso de material radiactivo. <ol><li> Preparar la sonda de ADN mediante el etiquetado de 25 - 50 ng del ADN que se hibrida con la membrana de acuerdo con protocolos estándar 12. Generar el fragmento de ADN mediante PCR o digestión del plásmido. Determinar la actividad específica de la sonda de ADN contando 1 l de la sonda de ADN radiomarcada después de los nucleótidos no incorporados se eliminan 12. </li><li> Tampón de prehibridación / hibridación Precalentar a 42 ° C. Utilice ~ 10 ml del tampón de prehibridación / hibridación por 100 cm 2 de la membrana 12. </li><li> Hibridan 1 - 5 x 10 6 cpm de sonda de ADN radiomarcada por ml de tampón de hibridación a la membrana O / N en un horno de hibridación para detectar el ARNm de interés 12. Asegúrese de que durante la hibridación de la rotación horno de hibridación es en una dirección quehace que toda la membrana al ser expuesto a la solución de hibridación, para asegurar la hibridación adecuada. </li><li> Lavar la membrana dos veces a temperatura ambiente durante 15 min con 50 ml de 2x SSPE y una vez en 65 ° C con 50 ml de 2x SSPE / SDS al 2% para 15 min 12. Envuelva la membrana en plástico para asegurarse de que no se seque o contamine la pantalla de fósforo. </li><li> Usando un contador Geiger, estimar la intensidad de la radiactividad en la membrana. NOTA: Este cálculo se asegura de que la membrana se expone a la pantalla de fósforo por la cantidad apropiada de tiempo. Utilice tiempos de exposición más largos para las membranas con bajas cantidades de radiactividad. </li><li> Para el norte de blots, use un control de carga para confirmar que la misma cantidad de ARN se cargan en cada punto. Para ello, tira de la membrana y reprobe con un ARN que no es afectada por el proceso siendo examinado. Franja de la membrana mediante la colocación en una bandeja de vidrio que contiene 200 ml de ebullición de la solución decapante (0,1% SDS / 0,01 XSSC) durante 2 min. Vierta la solución de extracción y repita el procedimiento cinco veces 12. NOTA:. Un ejemplo de un ARN utilizado como control de carga es SCR1 SCR1 es un transcrito de ARN polimerasa III que es estable y abundante SCR1 la abundancia de ARN no debería cambiar significativamente durante períodos cortos de RNA polimerasa II de inhibición.. </li></ol> 6. Cuantificar el ARN que se une a la membrana NOTA: Para cuantificar la cantidad de radiactividad en la membrana, exponer la membrana a una pantalla de fósforo. Después del tiempo de exposición adecuado, escanear la pantalla de fósforo mediante un fosforimager. <ol><li> Busque en la pantalla de fósforo usando las instrucciones proporcionadas por el fabricante del fosforimager. </li><li> Cuantificar el ARNm en cada punto de tiempo. Cuantificar los niveles de ARNm utilizando ImageQuant software o software relacionado. Normalizar el mRNA en cada punto de tiempo para el control de carga. Si SCR1 fue utilizado como la cargacontrol, normalizar los norteños de vida media para SCR1. </li><li> La vida media del ARNm se calcula dividiendo la cantidad de ARNm restante en cada punto de tiempo por la cantidad de ARNm presente en el punto de tiempo 0 (el punto de tiempo inicial). Grafica la ARNm por ciento restante en función del tiempo en una parcela semilogarítmica (Figura 2C). Calcular mRNA vidas medias por la siguiente ecuación: t 1/2 = -0,693 / k (negativo 0,693) </li><li> k es la pendiente de la línea de mejor ajuste y t medio es la vida media de mRNA. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

La inhibición de la síntesis de mRNA y el seguimiento de rotación de ARNm en la ausencia de nueva síntesis es un método que se utiliza frecuentemente para medir las tasas de descomposición de ARNm. En S. cerevisiae, la medición de las tasas de descomposición de ARNm mediante la inhibición de la transcripción mediante el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II es uno de los métodos más frecuentemente utilizados. Este método inhibe específicamente la ARN polimerasa II. Los pasos más...

La transcripción y la descomposición de ARNm específicos son determinantes cruciales de la expresión génica. La tasa de síntesis y descomposición de ARNm específicos determina el nivel de estado estacionario de que el ARNm particular. Los niveles de estado estacionario de ARNm regulan la abundancia de ARNm y determinar la cantidad de cada mRNA está disponible para la síntesis de proteínas. Las mediciones de ARNm vidas medias se utilizan ampliamente para determinar la tasa de descomposición de ARNm. MRNAs decaimiento específico a diferentes tasas que están relacionados con las características del ARNm, la función de la proteína codificada por el ARNm y las condiciones ambientales. Dependiendo de la técnica utilizada para determinar las tasas de descomposición de ARNm, mediciones de la tasa de descomposición se pueden determinar de forma global o por transcripciones individuales. En la levadura S. cerevisiae, las técnicas que se usan más comúnmente para medir las tasas de descomposición de ARNm global incluyen la utilización de una cepa de levadura que alberga el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II y transc químicainhibidores de riptional tales como thiolutin y 1,10-fenantrolina 1-5. Estos métodos también pueden ser utilizados para medir las tasas de descomposición de ARNm individuales 4. Otros métodos pueden utilizarse también para medir las tasas de descomposición de ARNm. Estos métodos incluyen enfoque de etiquetado de estado estacionario o la utilización de moléculas de ARNm que se expresan a partir de un promotor regulado que se expresa sólo en ciertas condiciones. Cada una de estas técnicas tiene ciertas ventajas y limitaciones. La técnica descrita aquí utiliza el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II. Este método utiliza S. cerevisiae como el modelo, pero puede sido modificado y utilizado en otros sistemas que utilizan técnicas de inhibición de la transcripción específicos 6. mRNA mediciones de vida media utilizando el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II se utilizan ampliamente para ambas mediciones a escala del genoma e individuales de mRNA decadencia 4-5. Esta técnica requiere el uso de un específic cepa de levadura que alberga un alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II, rpb1-1 1. El fundamento de esta técnica es que la exposición de la cepa de levadura sensible a la temperatura a la temperatura no permisiva inhibe la síntesis de mRNA. Posteriormente, el decaimiento del ARNm preexistente se controla en diferentes puntos de tiempo después de la transcripción se ha inhibido. La desaparición del mRNA preexistente se controla mediante la extracción de ARN a partir de las células de levadura en diferentes puntos de tiempo después de la transcripción se ha apagado. Los puntos de tiempo en el que se cosechan las células de levadura están predeterminados por un experimento piloto, y dependen de las transcripciones y sistema siendo investigados. Puntos de tiempo más rápidos se utilizan para transcripciones de corta duración, mientras que los puntos de tiempo más largos se utilizan para transcripciones de vida más larga. Después, el decaimiento del ARNm se controla por cualquiera de análisis de transferencia Northern, PCR cuantitativa o RNAseq. La medición de mRNA vidas medias usando una temperatura alelo sensible de la ARN polimerasa II tiene sus ventajas. En primer lugar, esta técnica es fácil y sencillo. En segundo lugar, una vez que la cepa de levadura se adquiere o se genera en el laboratorio de las mediciones de la vida media de ARNm se pueden determinar en diferentes condiciones de crecimiento; para determinación de la influencia del medio ambiente en mRNA decadencia. En tercer lugar, las tasas de descomposición de ARNm pueden ser monitoreados en todo el genoma. El uso de otras técnicas de inhibición de la transcripción también tiene ventajas y limitaciones. Por ejemplo, el uso de un promotor inducible requiere subclonación para generar un ARNm que está bajo el control del promotor regulado. Thiolutin no está fácilmente disponible y es caro cuando esté disponible. Además, el modo de thiolutin de acción no se entiende completamente y se ha informado a afectar a otros procesos celulares, incluyendo la inhibición de descomposición de ARNm 7. Alternativamente, 1,10-fenantrolina, es más fácilmente disponible. Además, todas las técnicas utilizadas para inhibir la transcripción puede perturb función celular y puede afectar a diferentes ARNm de maneras distintas. Un investigador debe determinar el método más apropiado para utilizar en sus condiciones experimentales para obtener los resultados más fiables. Para determinar qué método es el más adecuado para su aplicación, un investigador necesita identificar las transcripciones y función de las proteínas codificadas por las transcripciones que se investigan. Las mediciones de la tasa por mRNA decadencia más fiables son los que se determinó a través de múltiples técnicas y muestran la misma velocidad de desintegración. Ninguna técnica es siempre la mejor, y la técnica más apropiada depende de la situación específica. Numerosos estudios en S. cerevisiae han medido las tasas de descomposición de ARNm en diferentes condiciones y las bases genéticas. Las condiciones que las tasas de descomposición de ARNm se miden en dependen del experimento específico siendo investigado. Medición de las tasas de descomposición de ARNm en diferentes entornos celulares determina si las condiciones de serexaminados afectar preferentemente las tasas de descomposición de ARNm específicos. Las tasas de descomposición de ARNm también puede variar dependiendo de la cepa de levadura que se utiliza. Por ejemplo, las tasas de descomposición de ARNm se pueden determinar en células de levadura de tipo salvaje y las células de levadura con una vía funcional degradación del ARNm tontería mediada (NMD). Esta vía de degradación de ARNm se encuentra en todos los organismos eucariotas que se han examinado hasta ahora y que provoca la degradación de los ARNm que terminan prematuramente traducción 8. NMD se identificó inicialmente como una vía que degrada mRNAs con codones de terminación prematuros o codones sin sentido, pero ahora se reconoce como una vía que también regula la expresión de la no-absurdo que contiene mRNAs naturales. mRNAs que son objetivos de la vía se degradan rápidamente en células de levadura con una vía NMD funcional y se estabilizaron en células de levadura con una vía de NMD no funcional. Por lo tanto, la vida media de los ARNm que son blancos directos de esta vía son más cortos en levadura de tipo salvaje cells comparación con las células de levadura con una vía de NMD no funcional.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

los niveles de mRNA en estado estacionario varían dependiendo de las condiciones ambientales. La regulación de los niveles de acumulación estado estacionario de un ARNm asegura que la cantidad correcta de la proteína se sintetiza por las condiciones de crecimiento específicas de la célula. Un enfoque para medir las tasas de descomposición de ARNm es la inhibición de la transcripción y, posteriormente, el seguimiento de la desaparición de la ya presente mRNA. La tasa de descomposición de ARNm puede entonces ser cuantificada, y una vida media exacta se puede determinar utilizando varias técnicas. En S. cerevisiae, los protocolos que miden mRNA vidas medias han sido desarrollados e incluyen la inhibición de la transcripción de ARNm utilizando cepas que albergan un alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II, rpb1-1. Otras técnicas para la medición de mRNA media-vidas incluyen la inhibición de la transcripción con inhibidores transcripcionales tales como thiolutin o 1,10-fenantrolina, o alternativamente, mediante la utilización de mRNAs que están bajo el control de un promotor regulabletales como el promotor inducible de galactosa y el sistema TET-off. A continuación, describimos medición de S. las tasas de descomposición de ARNm cerevisiae utilizando el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II. Esta técnica se puede utilizar para medir las tasas de descomposición de ARNm de ARNm o de todo el genoma individuales.

<html> La capacidad de este protocolo para medir con precisión las tasas de descomposición de ARNm depende de la inhibición de la transcripción, la recolección de células de levadura en los momentos adecuados, y la utilización de técnicas de RNasa libre mientras que la extracción de RNA y el norte de borrones. El sondeo de dos mRNAs de control conocidos a ser inestable y estable, respectivamente, proporciona la confianza de que el experimento funcionó. Por ejemplo, esto se puede lograr mediante sondeo con una s...

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

El nivel de estado estacionario de ARNm específicos se determina por la velocidad de síntesis y la descomposición del ARNm. Las tasas de degradación de ARNm de todo el genoma o las tasas de descomposición de ARNm específicos se pueden medir mediante la determinación de ARNm de vida media. Este protocolo se centra en la medición de las tasas de descomposición de ARNm en Saccharomyces cerevisiae.

La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

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Video: Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Investigación

Biología

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR supervisado Redox La titulación de los cofactores de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Dirigida Método Evolución en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creación y Proyección

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...