La importancia del protocolo radica en su conveniencia en el corto tiempo necesario para su finalización. Esto permite un alto rendimiento, una alta concentración y un alto grado de aislamiento de los tricomas tallados y sésiles. La principal ventaja de esta técnica es su sencillez.
Durante esta técnica, se debe considerar la densidad de tricomas de la fuente de la planta e inspeccionar el grado de aislamiento en cada paso a través del microscopio mientras se realiza el protocolo por primera vez. Demostrando esta técnica estará Nurit Shalev, experta en cannabis del Centro Volcani. Comience aplastando un bloque de hielo seco en copos pequeños y finos con un martillo y un objeto duro y plano en un recipiente de plástico de cinco litros.
Use un colador grande y tamice los finos copos de hielo seco del hielo seco no triturado en otro recipiente de plástico de cinco litros. Vierta aproximadamente 200 centímetros cúbicos de los copos de hielo seco en un vaso de precipitados de vidrio vertical de un litro. Añade hasta 10 gramos de inflorescencias de cannabis sativa congeladas sobre la primera capa de hielo seco picado y cúbrelo con una capa adicional de 200 centímetros cúbicos de hielo seco finamente triturado.
Luego cubra la abertura del vaso de precipitados de vidrio de un litro con dos o tres capas de un mosquitero de una puerta de un milímetro y asegúrelo con bandas elásticas. A continuación, vierta nitrógeno líquido en un recipiente grande de acero inoxidable de fondo redondo. Inserte una malla de 350 micrómetros en un tamiz de harina o colador de tamiz para cubrir la malla de tamiz de harina desde abajo.
Coloque este tamiz de harina sobre el recipiente grande de acero inoxidable de fondo redondo lleno de nitrógeno líquido. Para minimizar la pérdida de la masa tamizada, asegúrese de que el ancho del recipiente exceda el del tamiz de harina. Separe los tricomas del material vegetal agitando el vaso de un litro con su abertura apuntando hacia abajo hacia el tamiz de harina.
Deje a un lado el vaso de precipitados cada dos o tres minutos, permitiendo el tamizado del hielo seco triturado y el material vegetal acumulado en el tamiz de harina. Tamizar el tamiz de harina horizontalmente para facilitar el paso del material vegetal al nitrógeno líquido en el recipiente de acero inoxidable de fondo redondo colocado debajo. A continuación, agregue nitrógeno líquido al recipiente de acero inoxidable y el hielo seco picado al vaso de precipitados de vidrio de un litro cuando sus niveles se agoten.
Cuando el material vegetal en el tamiz de harina se agote, vuelva a llenar el material vegetal usado en el vaso de precipitados de vidrio con 10 gramos adicionales de material vegetal fresco y repita el proceso de tamizado hasta la recolección de una cantidad suficiente de tricomas enriquecidos en el recipiente. Verifique la presencia de una sustancia blanca similar al polvo en el fondo del recipiente de acero inoxidable sumergido en nitrógeno líquido antes de una observación al microscopio para confirmar la recolección de suficientes tricomas. Agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido a un recipiente limpio y pequeño de acero inoxidable de fondo redondo.
Luego doble un microtamiz de 40 por 40 centímetros con un tamaño de malla de 150 micrómetros dos veces para obtener un pliegue de 20 por 20 centímetros, y ábralo en forma de cono. Asegure el cono de malla al borde del recipiente de acero inoxidable de fondo redondo con una o dos pinzas para la ropa para que la parte abierta del cono esté en posición vertical, y su parte puntiaguda esté parcialmente sumergida en nitrógeno líquido. Una vez hecho esto, vierta suavemente el nitrógeno líquido que contiene la sustancia blanca similar al polvo obtenida anteriormente en el cono del microtamiz.
Con un cepillo ancho, reúna y transfiera cualquier material vegetal restante del primer recipiente al cono de malla de 150 micrómetros. A continuación, separe con cuidado la pinza de la tapa del recipiente y abra el cono de microtamiz para ubicar los tricomas en el medio del microtamiz abierto. Mantenga las cuatro esquinas del microtamiz juntas y sumerja la parte media que contiene los tricomas en nitrógeno líquido.
Sumerja suavemente y agite el microtamiz en el nitrógeno líquido durante un minuto. Usando una aguja estéril, haga pequeños agujeros en la tapa de un tubo de ensayo de 50 mililitros para evitar la acumulación de presión. Coloque los restos de plantas no tamizados, el hielo seco y los tricomas más grandes envueltos en el centro del microtamiz en un tubo de ensayo de 50 mililitros y guárdelo a menos 80 grados centígrados para su uso futuro.
Transfiera los tricomas tamizados sumergidos en el nitrógeno líquido secuencialmente a través de microtamices, teniendo tamaños de vertido decrecientes de 105 a 80 a 65, y luego a 50 micrómetros. Después de cada transferencia, recoja los tricomas de diferentes tamaños que quedan en el microtamiz por separado y etiquételos. Haga pequeños orificios en la tapa del tubo con una aguja estéril.
Transfiera los tricomas deseados sumergidos en nitrógeno líquido y envueltos en el microtamiz de 50 micrómetros a un plato limpio con una cuchara preenfriada. Luego, transfiera rápidamente los tricomas similares al polvo a un tubo de 1.5 mililitros preenfriado etiquetado con una espátula preenfriada, e inmediatamente almacene los tubos a menos 80 grados centígrados para estudios adicionales. En la etapa inicial del proceso de aislamiento, predominaron trozos de tejido foliar en la porción aislada, en contraste con el producto de aislamiento final, que estaba compuesto completamente por tricomas aislados no contaminados.
La calidad de los tricomas granulares aislados de tallo capitado y sésil se observó en el paso final de aislamiento. La pureza de los tricomas aislados utilizando este método fue comparable con un protocolo convencional. Se conservó la delicada estructura de la cabeza de tricoma acechada, y todas las cabezas del tricoma acechado aislado eran visibles, en contraste con el método tradicional, donde faltaba la estructura completa de la cabeza del tricoma y solo estaban presentes las células del disco.
La extracción de ARN y la estimación de la integridad del ARN de los tricomas aislados indicaron un alto número de integridad de ARN o valores de RIN de 9,4 a 10, y la cromatografía en gel indicó una alta integridad de ARN. Realice cuidadosamente el movimiento de infusión similar a una bolsa T del aislamiento microtamizado de 150 a 50 micro microtamizados. Este método puede proporcionar información sobre la composición transcriptómica y probablemente proteómica de los tricomas del cannabis y los tricomas de otras especies de plantas.
Después de este procedimiento, se pueden realizar caracterizaciones metabólicas y transcriptómicas. Estos métodos adicionales pueden ayudar a comprender los niveles de expresión de los genes en los tricomas aislados y sus perfiles metabólicos. Esta técnica ha permitido la caracterización transcriptómica de tricomas glandulares de diferentes variedades de cannabis.
