Este trabajo fue apoyado por EE.UU. concede la National Science Foundation # MCB-0741914 y 0843627 MCB-, el apoyo de infraestructura adicional fue proporcionada en el City College de Nueva York por los Institutos Nacionales de Salud 2 RR03060 G12-26 del Centro Nacional para Recursos de Investigación. Agradecemos la JKC Rose grupo en el Departamento de Biología Vegetal de la Universidad de Cornell para proporcionar M82 (tipo salvaje) y CM15 (mutante) las cutículas de tomate. Agradecemos al Dr. Spyros Monastiriotis del grupo de Ingeniería Química CCNY del Prof. Alexander Couzis por su generosa ayuda con los experimentos de AFM. Agradecemos a la Sra. Laura Gohara de apoyo de diseño gráfico.

1. Aislamiento enzimática de las cutículas de tomate 5 <ol><li> Coloque los tomates varios comerciales o cultivadas en un recipiente. Pelar la piel de las frutas en grandes secciones; descartar el tejido del pericarpio interior. Lavar las pieles de tomate con agua desionizada y preservar ellos bajo el agua en un vaso de precipitados. </li><li> Preparar un 50 mM pH 4,0 tampón acetato de sodio (a 31 ° C) poniendo 1,22 g de acetato de sodio trihidratado (M r. 136,08 g / mol) y 2,34 ml de ácido acético glacial (17.485 M) en un vaso de precipitados, añadiendo 200 ml de agua desionizada, y luego ajustando el pH a 4,0 a 31 ° C. Preparar una mezcla que contiene 4 ml de pectinasa (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI América), 0,2 g de celulasa (CE 232.734.4; 1,3 unidades / mg de sólido, Sigma Aldrich), y 13 mg de NaN 3, y luego añadir 196 ml de tampón acetato de sodio a la mezcla de enzimas para obtener 200 ml del cóctel de enzimas final. 5 Sumerja completamente la piel de tomate pelado en el cóctel de enzimas e incubara 31 ° C durante 24 horas con agitación constante (G24 Ambiental Incubadora de Shaker, New Brunswick Scientific Co.). </li><li> Recoge las cáscaras de tomate con un colador de cocina, o el embudo Büchner y se lava con agua desionizada. Posteriormente, los coloca en una estufa de vacío a temperatura ambiente durante una hora. Preservar las pieles secas de tomate en una botella etiquetada y tapada para los procedimientos de desparafinado subsiguientes. </li></ol> 2. Desparafinado exhaustiva por extracción Soxhlet 6 <ol><li> El equipo utilizado para desparafinado exhaustiva consta de una fuente de calor (calefacción manto y el controlador Variac), matraz de fondo redondo de un depósito de disolvente, extractor Soxhlet, dedal de vidrio sinterizado o cartucho de extracción desechable, los chips anti-golpes y un condensador (ver fig. 1). Observe que el brazo sifón estrecho (partes 6 y 7 en la figura. 1) es muy delicado y propenso a la rotura, lo que requiere un manejo cuidadoso. </li><li> Ponga 0.5-1 g de piel de tomate (obtenido en elel paso 1.) en un mortero, y moler la muestra a un polvo grueso con un mortero a menos que las muestras se van a utilizar para las mediciones de AFM (Sección 5). Llenar un dedal de vidrio sinterizado o desechables aproximadamente hasta la mitad con la muestra y utilizar pinzas para colocar cuidadosamente en la base de la columna de extracción. </li><li> Poner el condensador y se envuelve con papel de aluminio. Calentar el disolvente de metanol (grado ACS) en presencia de unos pocos anti-bumping virutas hasta que hierva suavemente y reflujos en las paredes del matraz. Cubrir el depósito de disolvente con lana de vidrio tanto y papel de aluminio. Ver el proceso para una hora, ajustar el voltaje Variac manera que el depósito se acumula sobre una gota por segundo y sifón se produce dentro del aparato Soxhlet cuando el dedal está lleno. </li><li> Continuar el proceso de extracción durante 12 h, luego baje la manta calefactora y permitir que el aparato se enfríe. Quitar el extractor y el depósito como una sola unidad para disponer del disolvente. Utilice pinzasrs para elevar el dedal a justo por debajo del cuello de la columna de extracción, drenar el exceso de disolvente a partir de ella, y colocar el cartucho en una superficie limpia. Incline la columna de extracción para permitir sifón en el matraz a continuación. Desconecte el frasco y verter los residuos en un recipiente de desperdicio etiquetado solvente. </li><li> Repetir los pasos 2.3 y 2,4 para los disolventes sucesivas de polaridad disminuyendo progresivamente, por ejemplo, cloroformo y hexano durante 12 h en cada caso. </li><li> Permitir la muestra cutina tomate para secar el interior del dedal, ya sea por soplado de una corriente de gas nitrógeno sobre él o colocándolo en un horno de vacío a temperatura ambiente. Por último, medir la masa de la muestra seca y almacenar a temperatura ambiente en un frasco con tapa de rosca sellado con parafilm. </li></ol> 3. Aislamiento selectivo de ceras epicuticulares y Intracuticular 3,4 <ol><li> En primer lugar, lavar los tomates enteros (un lote por separado de los tomates de los descritos en 1.) Con agua destilada. Seque con paper y toallas Kimwipes, y el lugar que se derivan a la baja sobre un pedazo de papel de aluminio. </li><li> Pinte los tomates enteros, con un 120% (w / w, la relación de masa) de las encías árabe solución acuosa de arriba hacia abajo de la moda y permitir que alrededor de una hora para la goma árabe que se seque sobre la piel de la fruta, dejando una capa delgada. Retire esta película con unas pinzas, teniendo cuidado de no perforar la piel de tomate. Repita el procedimiento una vez más. </li><li> Añadir las películas a viales que contienen 1:1 (v / v) de cloroformo-agua y se mezcla durante tres minutos. Después de una agitación vigorosa y separación de fases, pipetear las fracciones de cloroformo y se evapora en viales separados cubierto, dejando cera epicuticular. Los tomates se mantendrán intactos físicamente. Sumergir ellos en cloroformo durante dos minutos a temperatura ambiente y recoger la cera intracuticular después de evaporar el disolvente. Ahora, la cáscara de los tomates y tratarlos enzimáticamente (con celulasa y pectinasa en tampón acetato de sodio) para eliminar la celulosa y pectina, respectivamente (como se describe en <strong&gt; 1). </li><li> Si se desea, realizar desparafinado exhaustiva sobre estas cutículas enzimáticamente aislados por extracción Soxhlet (ver paso 2), utilizando tres disolventes de polaridad variable (metanol, cloroformo, y hexano, respectivamente). </li></ol> 4. Caracterización molecular de cutina del fruto de tomate por polarización cruzada de ángulo mágico de Spinning de estado sólido de Resonancia Magnética Nuclear (CPMAS ssNMR) 6 <ol><li> Lugar 4.6 mg de cutículas de tomate totalmente desparafinada (las entrada) en un 1,6 mm fastMAS zirconia del rotor utilizando el suministrado por el proveedor de herramientas de embalaje. (Cualquiera de las cutículas de tierra desparafinados tomate o piezas muy pequeñas de las cutículas parcialmente desparafinados son adecuados.) Asegúrese de que la muestra está llena de manera uniforme, pero no con demasiada fuerza, en el rotor. Después de poner en la tapa superior, pintar la mitad de la tapa con un rotulador negro de tinta para facilitar la medición de la velocidad de giro. </li><li> Ajuste el número de calces del espectrómetro de RMN para el ancho mínimo de línea espectral a la mitad de la altura de unND calibrar el protón (1 H) y carbono (13 C) 90 ° anchuras de impulso utilizando un compuesto estándar tales como adamantano. </li><li> Uso de glicina o la glutamina como compuestos modelo, obtener la máxima intensidad de la señal mediante la optimización de todos los parámetros (Hartmann-Hahn emparejan los niveles de potencia, 1 H-13 C tiempo de contacto, heteronuclear 1 H fuerza disociación) de la polarización cruzada de ángulo mágico-hilado (CPMAS) experimento. Para espectros adquiridos en una frecuencia de 1 H, de 600 MHz, las condiciones recomendadas incluyen 10 kHz o 15 kHz de frecuencia hilado, un retardo de 3-sec entre las adquisiciones, y el protón ESPINAL heteronucleares desacoplamiento 7 a una intensidad de campo magnético equivalente a una frecuencia de 185 kHz. </li><li> Insertar el rotor cutina compacta en la sonda. Luego, coloque la sonda en el imán. Aumentar la velocidad de hilatura hasta 10 kHz gradualmente para comprobar si hay buena muestra de embalaje y la estabilidad del rotor. Verificar la estabilidad final hilatura del rotor dentro± 20 Hz. </li><li> Ajustar la puesta a punto y hacer coincidir los condensadores de la sonda de forma iterativa para lograr la reflexión de potencia mínima, tanto en 1 H y 13 C RMN frecuencias. Ajuste la temperatura experimental a 25 ° C (o temperatura ambiente). </li><li> Comienzo del experimento de pre-optimizado CPMAS correspondiente a la condición de Hartmann-Hahn coincidente determina en la frecuencia de 10 kHz hilatura. </li><li> Adquirir los transitorios de 4096, la condición del espectro con la exponencial (Lorentz) línea de ampliación de 50 a 100 Hz, y hacer una transformada de Fourier para generar un espectro de RMN de la intensidad de la señal frente a productos químicos de protección (ppm). </li><li> Referencia del producto químico C 13 turnos de forma externa mediante conjunto adamantano al 38,4 ppm (-CH 2 - grupo) 8 como estándar. </li><li> Aumentar la frecuencia del rotor girando a 15 kHz y repetir la medición CPMAS (pasos 4,6-4,8) correspondiente a la condición de Hartmann-Hahn coincidente determinado a esta frecuencia último girando. </li><li> Repeen los experimentos CPMAS (pasos 4.1-4.9) con muestras cutícula naturales (ceroso) y desparafinado parcialmente la fruta. </li></ol> 5. Sondeo de la superficie de la cutícula de tomate con Microscopía de Fuerza Atómica (Digital Instruments Nanoscope IIIa, los procedimientos pueden variar ligeramente entre microscopios) 6 <ol><li> Encienda el microscopio de sonda de barrido (SPM) (Fig. 2) y asegúrese de que el interruptor de modo de microscopio toggle se establece como la Microscopía de contacto Fuerza Atómica (AFM) de modo. </li><li> Manual de levantar la cabeza SPM girando sus dos ajustables por el usuario mandos frontales. Separe la tipholder AFM de la cabeza del SPM, girando el tornillo de sujeción en la parte posterior de la cabeza. </li><li> Use unas pinzas para quitar la existente cantilever de AFM de la tipholder, luego, con cuidado agarra una palanca de silicio nitruro de nuevo (Sonda de AFM) de su paquete e instalarlo en el lugar de la viga de edad. Utilice un microscopio de luz para comprobar que el recién instalado en voladizo AFM no está roto. </li><li> Adjuntar ºde tomate e la cutícula de la muestra (una sección de la cutícula de tomate parcialmente desparafinados ~ 10 mm x 10 mm) en un disco de acero inoxidable (muestra puck) con cinta de doble cara. Utilizar un microscopio de luz para verificar que la superficie de la cutícula permanece plana y lisa después de la colocación de la muestra sobre el disco. </li><li> Coloque el disco con la muestra cutícula tomate en la región magnético en la parte superior del escáner SPM. </li><li> Ajuste los dos tornillos delanteros de ajuste manual del escáner de alta girando las perillas, establecer el tornillo posterior ajuste motorizado de aproximadamente el mismo nivel que los otros dos tornillos delanteros. Asegúrese de que los tres tornillos están lo suficientemente alto para evitar que se rompa la punta del AFM al colocar la tipholder en la cabeza del SPM. </li><li> Vuelva a insertar el tipholder en la cabeza del SPM y fijarlo apretando el tornillo de sujeción en la parte posterior de la cabeza. </li><li> Después de encender el láser, alinee el punto láser en el cantilever de AFM con la central (y) y derecha (x) perillas de ajuste del láser en la parte superior de la cabeza.Controlar el haz láser reflejado en un trozo de papel para colocar el punto láser exactamente en el extremo del voladizo AFM. </li><li> Ajustar la posición del espejo móvil iterativamente utilizando los botones de ajuste fotodetector para lograr la máxima señal (señal SUM), asegurando así que el haz de láser reflejado se está recibiendo uniformemente por los cuatro cuadrantes del fotodetector. </li><li> Bajo la punta del AFM por retracción de los tornillos de ajuste manual del frente y el tornillo posterior ajuste motorizado del escáner SPM, visualmente supervisar el enfoque de la punta del AFM hacia la superficie de la muestra con un microscopio invertido. Asegúrese de que los tres tornillos en el mismo nivel para evitar los artefactos de la imagen de una muestra inclinada. Llevar la punta hacia la muestra, pero no tan cerca que los toques de punta o se rompe a través de la superficie de la muestra. </li><li> En este punto, la luz láser reflejada por el cantilever de AFM rebotará en el espejo móvil de la célula fotoeléctrica. Para el modo de contacto AFM con una siliconaCon nitruro de punta de AFM, establezca la señal de salida (desviación vertical) de tensión a -2 V para un punto de ajuste de 0 V y la señal de DIF (vertical / horizontal de diferencia) a 0 V mediante el ajuste de la posición del espejo. </li><li> Usando el software de Nanoscope, haga clic en el icono de microscopio y seleccionar el perfil adecuado (modo de contacto AFM). </li><li> Uso de la &quot;Configuración de la exploración Controles&quot; del panel, configurar la velocidad de barrido y, por ejemplo tamaño de escaneado, de 10 micras de tamaño de exploración y 2 Hz frecuencia de barrido. </li><li> Permita que la punta del AFM para enganchar la superficie de la muestra haciendo clic en el icono de participar de punta. Al controlar el tornillo posterior motorizado de la base de SPM, el programa ahora bajará la punta hasta que se acopla a la superficie de la muestra. El proceso de exploración se iniciará automáticamente una vez que la punta ha participado con éxito. </li><li> Supervisar el proceso de exploración utilizando ambos modos de imagen y el alcance del software, el ajuste de parámetros como consigna, ganancia integral, la ganancia proporcional, tamaño de escaneado, velocidad de exploración, las líneas y las muestras por línea iterativa para alcanzar el más altoimágenes de alta resolución. Inicie la exploración con un gran eje z rango (escala de datos); luego cuidadosamente reducir el valor de la escala de datos para observar el mejor contraste de características de la superficie sobre la imagen. Minimizar la aparición de zonas blancas en la imagen escaneada, los cuales indican que la altura de las características de la superficie superior a la disponible eje z rango. </li><li> Para capturar la imagen para guardar el archivo de datos, y luego procesar los datos utilizando las funciones de aplanamiento para eliminar artefactos de la imagen debido al desplazamiento vertical del escáner (Z), los arcos de la imagen, y el desplazamiento vertical entre las líneas de exploración, 9, finalmente calcular la rugosidad media. Después de guardar los datos, retraer la punta del AFM mediante la inversión de la acción del motor del tornillo controlado por computadora que se utilizó para participar. El procesamiento de imágenes puede realizarse en modo fuera de línea de análisis de imagen y / o utilizar un equipo diferente. </li><li> Utilice los mandos frontales inferiores grises de metal de la titular de la punta para cambiar las posiciones x e y de la zona de exploración, y luego repetir la operación en la muestra cinco ubicaciónciones para comprobar la reproducibilidad, en sustitución del cantilever de AFM, si la calidad de imagen se deteriora. </li></ol> 6. Los resultados representativos El análisis químico desplazamiento de la CPMAS 13 espectros RMN de C (Fig. 3) identificaron los principales grupos funcionales presentes en la cutícula tomate exhaustivamente desparafinado (cutina). Los restos de carbono clave en la biopolyester cutina resultaron ser alifáticos de cadena larga (0-45 ppm), alifáticos oxigenados (45-110 ppm), se multiplican unidos-y aromáticos (110-160 ppm), y carbonilos (160-220 ppm). Los restos alquilo oxigenados (CHO + CH 2 O) juegan un papel crucial en el establecimiento de conexiones covalentes entre las unidades monoméricas del biopolímero cutina, formando de este modo la arquitectura molecular de la matriz de cutina. Las diferencias en áreas de los picos relativos observados en la región espectral entre 45 ppm y 100 indican que la cutina mutante tiene una proporción relativamente grande de conformación structura reticulación CHO<html> fracciones l en comparación con el tipo salvaje cutina, cuidadosas mediciones cuantitativas, mediante la polarización directa (DPMAS) RMN 5 métodos de apoyar esta inferencia (datos no mostrados). CPMAS 13 C espectros de RMN también mostró un pico de cera disminuyendo progresivamente a 31 ppm (fig. 4), lo que indica la eliminación secuencial de epi-y ceras intracuticular del compuesto cutina-cera mientras que conserva la arquitectura química principal del biopolímero cutina. Análisis paralelo imagen AFM (fig. 5) reveló irregularidades de la superficie debido a la extracción gradual de epi-y ceras intracuticular de la cutícula de fruta, lo que significa alteraciones en la organización del conjunto cuticular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg" /> . Figura 1 extractor Soxhlet (origen de la imagen: Wikipedia). &quot;/&gt; Figura 2. Un microscopio de barrido) de la sonda. B) SPM cabeza (adaptado del manual de capacitación AFM proporcionada por Digital Instruments). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg" /> Figura 3. 150 MHz CPMAS 13 C espectros de RMN de manera exhaustiva desparafinados rojos cutículas maduras del fruto de tomate (las entrada) de tipo salvaje (M82) y mutante (CM15) muestran resonancias con los desplazamientos químicos correspondientes a los grupos funcionales de un ácido hydroxyfatty reticulado basado en poliéster y también algunos restos multiplican unidos. Todos los espectros fueron adquiridos con una frecuencia de 10 kHz girando. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg" /> Figura 4. 150 MHz 13 CCPMAS espectros de RMN de los comerciales de tomate rojo maduro cutículas fruta exhiben cambios en la composición sobre la eliminación secuencial de las ceras y epicuticulares intracuticular por la goma de mecánica de extracción árabe y un two minutos de inmersión en el cloroformo, respectivamente. Todos los espectros fueron adquiridos con una frecuencia de 15 kHz girando. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg" /> Figura 5. Imágenes AFM y estimaciones de rugosidad para el tomate parcialmente desparafinados comercial cutículas descrito en la Figura 4 después de la eliminación gradual de epicuticulares (izquierda) y intracuticular (derecha) las ceras.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science.">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los protocolos descritos aquí permiten la caracterización molecular detallada y microescala de un material vegetal intratable complejo sin la necesidad de descomposición química destructiva. Para investigar la fusión de la biopolyester cutina con diversos lípidos (ceras) que controlan la estructura orgánica de la asamblea cuticular, 10 llevamos a cabo y supervisar los procedimientos para la eliminación selectiva de las ceras y epicuticulares intracuticular partir de la mezcla heterogénea cuticular. De estado sólido 13 C RMN se utilizó para medir la extracción de los componentes de cera moleculares, y microscopía de fuerza atómica sirve para examinar los cambios concomitantes en la rugosidad superficial. 6,11 Para comparar las capacidades de reticulación de las entrada de cultivo de tipo salvaje y de un solo gen las frutas mutantes de tomate, de estado sólido de 13 C RMN también se utilizó para estimar el número relativo de CHO y CH 2 O restos de productos químicos. Una serie de característica de diseños de este protocolo son notables. Como los materiales de cera abarcar una amplia gama de lípidos, el tratamiento de la cutícula fruta con una serie de disolventes que tienen polaridades divergentes es esencial para lograr desparafinado exhaustiva. Además, el tiempo de desparafinado puede variar de 8 horas a 24 horas dependiendo de la naturaleza de las muestras de la cutícula. Para extraer las ceras epicuticulares consistentemente de la cutícula de frutas intactos, es imperativo para aplicar el revestimiento adhesivo de manera uniforme a la superficie. De estado sólido CPMAS 13 C RMN 12 es un método rápido cualitativo para la identificación de diferentes componentes estructurales de biopolímeros vegetales altamente heterogéneas e insoluble preservando al mismo tiempo sus características físicas nativas; 13 tradicional solución RMN en estado también se puede utilizar para caracterizar las mezclas de cera extraídos. Si estimación cuantitativa de los grupos funcionales se desea para los polímeros de plantas intactas, 5 de alta fidelidad directa de polarización de ángulo mágico de hilatura (DPMAS) 13 C RMN 5,14 se debe utilizar como un método complementario. Cuantificación exacta de los grupos funcionales requiere la optimización cuidadosa de los tiempos de reciclado, las longitudes de excitación del pulso y la fuerza de la disociación heteronuclear. 15 La desvinculación heteronuclear se pueden establecer para una intensidad de campo H 1 que van desde 50 kHz a 185 kHz utilizando el TPPM 16 o LA COLUMNA VERTEBRAL 7 metodologías. Además de estos parámetros, la sensibilidad de las mediciones CPMAS depende del tiempo de giro de bloqueo y Hartmann-Hahn condición coincidente. 15 En lugar de CPMAS tradicionales, una rampa de amplitud CP (RAMP-CP) técnica puede ser implementada para maximizar la cruz -polarización eficiencia mediante la variación de la amplitud 1 H linealmente (~ 20-50%) o tangencialmente, manteniendo la amplitud de intensidad de campo 13 C constante durante el periodo de giro de bloqueo (o viceversa). 17,18 Realización de las mediciones en CPMAS un mínimo de dos ro diferentetor de hilado de frecuencias es imprescindible para distinguir bandas laterales giratorios de los picos espectrales principales. Simultáneas llevadas a cabo mediciones de AFM en el modo de contacto permiten la imagen directa de la condición de superficie de la cutícula con velocidades de escaneo de alta resolución y alta, 19 por ejemplo, durante la eliminación secuencial de los componentes de cera. Operando AFM en tapping (sin contacto) modo se puede utilizar como una alternativa para la caracterización de la superficie de delicados materiales &quot;blandos&quot; de plantas, evitando posibles daños debido a laterales (corte) fuerzas y raspado de la superficie de la muestra. 5,20 En cualquier caso , la adquisición secuencial de múltiples imágenes del mismo lugar en la superficie sirve para identificar cualquier daño en la superficie debido a la &quot;superficie de la sonda de interacciones&quot; en las mediciones de AFM. 6,21 Para la reproducibilidad óptima, las sondas de AFM con constantes de resorte adecuado para superficies blandas cuticulares debe ser utilizado, y la constancia de la temperatura y la humedad debe mantenerse. 6,15,20 </sa&gt; Considerando RMN en estado sólido ofrece un perfil molecular del conjunto de la media (a granel) en las propiedades de las cutículas de la fruta del tomate, la imagen de fuerza atómica proporciona una sonda complementaria no invasiva 22,23 para el seguimiento de la topografía de la superficie de estas asambleas macromoleculares exquisitamente complejas. 1,2

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog no.</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8625-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0026</td>
			<td>EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1184-100KU</td>
			<td>EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9967</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Extremely hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific Co.</td>
			<td>Model No.G24</td>
			<td>MFG No.M1036-000G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>31566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variac Controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sintered glass thimble (85 mm/25mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EMD-MX0485-7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RK20789</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-452</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1050-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89002-984</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9752</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 mm fastMAS zirconia rotor</td>
			<td>Varian (Agilent)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Varian 600 NMRS</td>
			<td>standard bore magnet</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49419</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adamantane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100277</td>
			<td>To calibrate 90&deg; pulse in NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA)</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip)</td>
			<td>Veeco (Bruker AXS)</td>
			<td>Model NP-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic puck</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit Peeler</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and biophysical study of fruit cuticles

La cutícula, una capa hidrofóbica de protección en las partes aéreas de las plantas terrestres, funciona como una barrera defensiva versátil a varios estreses bióticos y abióticos, y también regula el flujo de agua desde el ambiente externo. 1 A biopolyester (cutina) y largas cadenas de ácidos grasos ceras) forman el marco estructural principal de la cutícula; la integridad funcional de la capa cuticular depende del exterior &#39;epicuticular&#39; capa, así como la mezcla que consiste en el biopolímero cutina y ceras de intracuticular de 2 Aquí, se describe un protocolo integral. para extraer de forma exhaustiva las ceras de tomate comercial (Solanum lycopersicum) de frutas o las cutículas para eliminar las ceras y epicuticulares intracuticular secuencialmente y de forma selectiva del compuesto de la cutícula. El método de la máquina y su Schäffer (2001) fue adaptada para la extracción gradual de las ceras y epicuticulares intracuticular de la cutícula de la fruta. 3,4 Para controlar laproceso de eliminación de la cera secuencial, de estado sólido de polarización cruzada magia de ángulo de giro (CPMAS) 13 C RMN se utiliza en paralelo con la microscopía de fuerza atómica (AFM), que proporciona a nivel molecular perfiles estructurales de los materiales a granel, complementadas con información sobre la topografía microescala y la rugosidad de las superficies cuticulares. Para evaluar la capacidad de reticulación de las cutículas desparafinados de frutos de tomate cultivadas de tipo salvaje y de un solo gen mutante, el MAS RMN de 13 C se utilizó para comparar las proporciones relativas de los hidrocarburos alifáticos oxigenada (CHO y CH 2 O), restos químicos. Desparafinado exhaustiva por extracción Soxhlet en etapas con un panel de disolventes de polaridad variable proporciona un medio eficaz para aislar restos de cera sobre la base de las características hidrofóbicas de su alifáticos y compuestos aromáticos, mientras que preserva la estructura química de la biopolyester cutina. La extracción mecánica de ceras epicuticulares y Seleeliminación de ceras ctive intracuticular, cuando son supervisados ​​por metodologías complementarias físicas, proporciona un medio sin precedentes para investigar el conjunto cutícula: este enfoque revela que la organización supramolecular y la integración estructural de varios tipos de ceras, la arquitectura de la matriz de cutina-cera, y la química la composición de cada componente. Además, de estado sólido de 13 C RMN revela diferencias en los números relativos de CHO y CH 2 O restos químicos de tipo salvaje y mutante frutas rojas maduras de tomate. Las técnicas de RMN ofrecen herramientas excepcionales para huella de la estructura molecular de los materiales que son insolubles cuticulares, amorfo, y heterogéneo químicamente. Como una técnica de imagen no invasiva de superficie selectiva, AFM proporciona un medio eficaz y directo para sondear la estructura orgánica de la asamblea cuticular en la escala de longitud de nm-m.

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Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Órganos aéreos de las plantas están protegidos por la cutícula, una supramolecular biopolyester la cera de montaje. Se presentan los protocolos para controlar la eliminación selectiva de epi-y las ceras de la cutícula intracuticular fruta de tomate en las escalas moleculares y micro por la RMN en estado sólido y la microscopía de fuerza atómica, respectivamente, y para evaluar la capacidad de entrecruzamiento de ingeniería biopolyesters cuticulares.

El aislamiento y estudio biofísico de las cutículas de fruta

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.6K vistas.  City College of New York, City University of New York Graduate Center and Institute for Macromolecular Assemblies. Órganos aéreos de las plantas están protegidos por la cutícula, una supramolecular biopolyester la cera de montaje. Se presentan los protocolos para controlar la eliminación selectiva de epi-y las ceras de la cutícula intracuticular fruta de tomate en las escalas moleculares y micro por la RMN en estado sólido y la microscopía de fuerza atómica, respectivamente, y para evaluar la capacidad de entrecruzamiento de ingeniería biopolyesters cuticulares.

Video: Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Investigación

Biología

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

El estudio de la agresión en Drosophila (mosca de la fruta)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit aroma. Maturity at harvest is one of the key factors influencing the flavor quality of fruits and vegetables1. The validation of robust methods that rapidly assess fruit maturity and aroma quality would allow improved management of advanced breeding programs, production practices and postharvest handling. 
Over the last three decades, much research has been conducted to develop so-called electronic noses, which are devices able to rapidly detect odors and flavors2-4. Currently there are several commercially available electronic noses able to perform volatile analysis, based on different technologies. The electronic nose used in our work (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), consists of ultra-fast gas chromatography coupled with a surface acoustic wave sensor (UFGC-SAW). This technology has already been tested for its ability to monitor quality of various commodities, including detection of deterioration in apple5; ripeness and rot evaluation in mango6; aroma profiling of thymus species7; C6 volatile compounds in grape berries8; characterization of vegetable oil9 and detection of adulterants in virgin coconut oil10. 
This system can perform the three major steps of aroma analysis: headspace sampling, separation of volatile compounds, and detection. In about one minute, the output, a chromatogram, is produced and, after a purging cycle, the instrument is ready for further analysis. The results obtained with the zNose can be compared to those of other gas-chromatographic systems by calculation of Kovats Indices (KI). Once the instrument has been tuned with an alkane standard solution, the retention times are automatically converted into KIs. However, slight changes in temperature and flow rate are expected to occur over time, causing retention times to drift. Also, depending on the polarity of the column stationary phase, the reproducibility of KI calculations can vary by several index units11. A series of programs and graphical interfaces were therefore developed to compare calculated KIs among samples in a semi-automated fashion. These programs reduce the time required for chromatogram analysis of large data sets and minimize the potential for misinterpretation of the data when chromatograms are not perfectly aligned.
We present a method for rapid volatile compound analysis in fruit. Sample preparation, data acquisition and handling procedures are also discussed.

A rapid method for volatile compound analysis in fruit is described. The volatile compounds present in the headspace of a homogenate of the sample are rapidly separated and detected with ultra-fast gas chromatography (GC) coupled with a surface acoustic wave (SAW) sensor. A procedure for data handling and analysis is also discussed.

Frutas volátil análisis mediante una nariz electrónica

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Caracterización biofísica de las funciones de motor flagelar

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...