Los autores quieren agradecer a Céline Jeanty su ayuda en la creación de pellets celulares con tratamiento de MG-132 como se describe en los resultados representativos y a Elise Mommaerts por su provisión de pellets E. coli utilizados en el protocolo.

1. Preparación de un estándar de péptido pesado
<ol><li>Dependiendo del proveedor y la calidad de los péptidos pesados comprados, los péptidos pesados tendrán que diluirse. Este protocolo utilizó las secuencias de péptidos notificadas en la Tabla 1,con el aminoácido C-terminal modificado a lisina(13C615N2-lisina) o arginina (13C615N4-arginina).<ol>
<li>Mezcle los péptidos pesados, diluyendo la mezcla con acetonitrilo (ACN) al 50% para crear una mezcla de péptidos con cada péptido a 10 μM.</li>
		<li>Crea alícuotas de la mezcla de péptidos y guárdalos a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de muestras
<ol><li>Lisis de muestra NOTA: La estabilidad de las cadenas de ubiquitina debe considerarse durante la preparación de la muestra. Mantenga las muestras biológicas y los tampones refrigerados a 4 °C y agregue muestras al búfer de estabilización de ubiquitina lo más rápido posible.<ol>
<li>Preparar una solución de 1 M NH4HCO3 (bicarbonato de amonio) en agua y ajustar el pH a 8 usando 1 M NaOH.</li>
		<li>Preparar una solución de 200 mM N-etillmaleimida (NEM) en agua.</li>
		<li>Preparar el búfer de estabilización de ubiquitina utilizando 8 M urea en 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. El búfer de estabilización de Ubiquitina debe prepararse constantemente cada vez. NOTA: Una solución de 5 ml de urea de 8 M requerirá considerablemente menos de 5 ml de agua dada la expansión del agua cuando se encuentra en una solución saturada con urea. PRECAUCIÓN: No prepare el búfer por encima de 50 °C debido a la tendencia de la urea a formar poliurea a altas temperaturas.</li>
		<li>Resuspend la muestra biológica que se investigará en el búfer de estabilización de ubiquitina con el objetivo de 0,5 μg/μL de proteína y lisa las células con un método adecuado para la muestra. Se utilizó un método de sonicación que consta de tres pulsos de 10 s con un sonificador SFX 150 Branson establecido en un 70% de intensidad con roturas de 10 s en hielo entre cada pulso, para las líneas celulares de este protocolo.</li>
		<li>Muestra de centrífuga a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 °C en una centrífuga de mesa.</li>
		<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de unión a proteínas bajas y frescas. Las muestras se pueden almacenar a -20 °C en este punto si es necesario.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de muestras y controles
	<ol>
<li>Si las muestras están congeladas, mezcle (por ejemplo, con un termomixer) mientras se descongelan para disolver rápidamente la urea. PRECAUCIÓN: No utilice temperaturas superiores a 50 °C debido a la tendencia de la urea a formar poliurea a altas temperaturas.</li>
		<li>Muestra de centrífuga a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 °C en una centrífuga de mesa.</li>
		<li>Transfiera 20 μg de muestra a un tubo de microcentrífuga de baja unión fresco y ajuste el volumen a 50 μL con un búfer de estabilización de ubiquitina.</li>
		<li>Cree un control negativo utilizando un volumen normalizado de búfer de estabilización de ubiquitina (50 μL). En esta muestra, no debe estar presente ninguna versión ligera de cada péptido, lo que permite observar cualquier contaminación lumínica derivada de los péptidos pesados. Este control negativo también se utilizó para la programación del tiempo de retención del PRM descrito en la sección 3.1.</li>
		<li>También se creó un control positivo con búfer de estabilización de ubiquitina y la adición de tipos de cadena disponibles comercialmente al volumen normalizado de búfer de estabilización de ubiquitina (50 μL). Comúnmente, K63, K48 y M1 están disponibles. En los resultados representativos se utilizaron 20 ng de K48, K63 y M1.</li>
	</ol></li>
	<li>Reducción, alquilación y digestión
	<ol>
<li>Preparar una solución de bicarbonato de amonio de 50 mM (NH4HCO3)en agua y ajustar la muestra a pH = 8 con 1 M NaOH.</li>
		<li>Un cultivo de E. coli cultivado en caldo LB fue centrifugado 5.000 x g durante 5 minutos para formar un pellet, que luego fue lavado 2 veces con PBS antes de la resuspensión en el búfer de estabilización de ubiquitina a 5 μg/μL.</li>
		<li>Agregue 1 μg de E. coli lysate a cada muestra y control. Este protocolo utiliza E. coli (DH10B), pero se puede utilizar cualquier lisato complejo sin ubiquitina. Tenga en cuenta que la ubiquitina es común a todos los eucariotas. NOTA: El uso de una matriz de lisato de E. coli reduce la pérdida de péptidos debido a la adhesión inespecífica a los utensilios de plástico. Esto es particularmente notable en el control negativo o muestras con un contenido limitado de proteínas y tiene un fuerte impacto en la observación de K6312.</li>
		<li>Preparar una solución de 500 mM tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en agua de grado MS (TTT se puede utilizar como alternativa).</li>
		<li>Reduzca las muestras y controles mediante la adición de TCEP a una concentración final de 50 mM. Vórtice brevemente antes de incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Si se utiliza TDT, la temperatura debe elevarse a 50 °C. PRECAUCIÓN: No utilice temperaturas superiores a 50 °C debido a la tendencia de la urea a formar poliurea a altas temperaturas.</li>
		<li>Preparar una solución de cloroacetamida de 550 mM (CAA) en NH4HCO3. Almacenar en la oscuridad.</li>
		<li>Alquile las muestras y controles añadiendo CAA a una concentración final de 55 mM. Vórtice brevemente antes de incubar durante 20 minutos en RT en la oscuridad. NOTA: Caa se utiliza en lugar de iodoacetamida como agente de reducción para disminuir la probabilidad de una doble modificación carbamidometil (114.0429) en un residuo de lisina que se confunde con una modificación -GG (114.0429)13.</li>
		<li>Agregue la LysC de endopeptidasa a las muestras a una relación de 1:25 (w/w) con el contenido de proteínas. Incubar durante 3 h a 37 °C.</li>
		<li>Diluir las muestras y controles con 200 μL de 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Agregue trippsina a las muestras a 1:25 w/w de relación con el contenido de proteínas. Incubar durante 12 h a 37 °C.</li>
		<li>Agregue un 10% de solución de ácido fórmico (FA) en agua de grado MS a una relación v/v de 1:10 a cada muestra y muestra de control. Compruebe que el pH es <3) antes de la limpieza C18 y agregue más ácido fórmico si es necesario.</li>
		<li>A cada muestra y control añadir 0,5 μL del estándar de péptido pesado creado en la sección 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpieza de péptidos
	<ol>
<li>Varios fabricantes ofrecen puntas o placas de limpieza C18. Siga las instrucciones del fabricante para el producto utilizado y péptidos elutados secos en una centrífuga de vacío, listos para el análisis de EM.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis por LC-MS/MS
<ol><li>Ejecute el análisis inicial de PRM en el estándar de péptido pesado de una manera no programada.<ol>
<li>Resuspend las muestras secas en 10 μL de amortiguador de carga de EM 2% ACN/0.05% ácido trifluoroacético (TFA).</li>
		<li>Equipe un HPLC con una columna analítica C18 de fase inversa (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 cuentas Å C18) diseñada para nanoflujo MS. Formar gradientes lineales intercambiando agua de grado MS complementada con 0.1% FA con ACN que contenga 0.1% FA. Aquí se utilizó una columna trampa de sacrificio (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 cuentas Å C18) para preservar la vida útil de la columna analítica, pero no es necesario.</li>
		<li>Acopla la salida de la columna analítica a una fuente nanoESI en un espectrómetro de masa de alta resolución.</li>
		<li>Utilice un método proteómico dirigido adecuado para el espectrómetro de masas. Por ejemplo, en un Q-Exactive más un método de dos experimentos, entre una EM completa y un experimento PRM. Para el experimento Full MS, se utilizó una resolución de 120.000 con un objetivo de AGC de 1e6 y 240 ms como TI máxima. Para el experimento PRM, se utilizó el mismo objetivo AGC y ti máximo con una resolución más baja de 60.000 y una ventana de aislamiento de 1,2 m/z.</li>
		<li>Inyecte 200 ng del control negativo en la columna analítica utilizando el autoamplificador HPLC. Aplique un degradado lineal a la muestra en la columna analítica aumentando la concentración acn del 2 al 25% durante un período de ~45 min. NOTA: La concentración de 25% de ACN es menor de lo habitual para la proteómica debido a la baja naturaleza hidrófila de los péptidos típicos de la topología-característica de la ubiquitina. Si se van a cuantificar otros péptidos, se puede desear una mayor concentración de ACN para lograr una buena separación del objetivo.</li>
		<li>Analice los resultados de la ejecución de programación como se describe en la sección 4.2 para crear una lista de inclusión programada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de las muestras<ol>
<li>Ejecute los ejemplos restantes como se describe para la programación en 3.1 aparte del uso de la lista de inclusión programada creada en la sección 4.2. NOTA: Un espacio en blanco debe ejecutarse después del control positivo para asegurarse de que no se detecta ningún arrastre de la ejecución anterior en muestras posteriores.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de software
<ol><li>Cree una lista de inclusión del formato adecuado para la EM utilizada. Este protocolo utilizaba el software de código abierto Skyline (versión 19.1.0.193) (https://skyline.ms), que ofrece soporte y ayuda bien documentados. Se puede crear una lista de inclusión para varios espectrómetros de masas mediante la instalación de lista de aislamiento de exportación.<ol>
<li>Abra un nuevo documento skyline.</li>
		<li>Seleccione modificaciones de isótopos pesados según corresponda a péptidos de alta tecnología-característica. En Configuración| Configuración del péptido en la pestaña Modificación, haga clic en el campo nombre para ver la posible modificación. La selección se basa en el estado isotópico de los péptidos pesados comprados. En este ejemplo, se utilizaron péptidos sintéticos que llevaban lisina pesada(13C615N2-lisina) o una arginina pesada(13C615N4-arginina) en la terminal C. Las etiquetas apropiadas serían: "Etiqueta:13C(6)15N(2) (C-term K)" y "Etiqueta:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Seleccione Configuración| Transición. En la ficha Filtro se incluyen Cargos precursores 2, 3, 4.</li>
		<li>Inserte péptidos seleccionando Editar| Insertar| Péptidos.</li>
		<li>Rellene los campos relevantes, incluida la secuencia de péptidos de carácter topológico y un nombre proteico (por ejemplo, "Cadena-K63").</li>
		<li>Expanda cada péptido que se muestra ahora en el panel Objetivos. Elimine los estados de cargo no deseados. El estado de carga preferido y la energía de colisión, que pueden diferir en función del espectrómetro de masa utilizado, para cada péptido de topología-característica se muestra en la Tabla 1.</li>
		<li>Para cada péptido topología-característica (excepto M1 donde se incluye el GG en la secuencia) haga clic con el botón derecho en la secuencia y seleccione Modificar. Agregue un GG como una modificación estructural haciendo clic en el campo de nombre y seleccionando <Mostrar todo... > antes de seleccionar "GlyGly (K)".</li>
		<li>Exporte la lista de aislamiento Archivo| Exportación| Lista de aislamiento, seleccione el tipo de instrumento y establezca el tipo de método en Estándar. Al seleccionar Aceptar, se abrirá un mensaje para guardar un archivo *.csv que se puede usar para crear un método PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>Cree una lista de inclusión programada basada en una ejecución de programación de péptidos pesados que se explica aquí utilizando el software Skyline de código abierto.<ol>
<li>Cree una lista de destino como se describe en la sección 4.1.</li>
		<li>Importe la ejecución de programación en 3.1 seleccionando Archivo| ¿Importación| Resultados.</li>
		<li>Revise las identificaciones. La señal pesada para cada péptido es observable haciendo clic en la masa para cada entrada de péptido pesado. El reconocimiento correcto del pico a menudo se determina automáticamente, pero el software puede requerir curación manual seleccionando el pico mediante el clic y arrastre bajo el eje X.</li>
		<li>Los tiempos de retención seleccionados para las variantes pesadas también se aplican a las versiones de luz, creando así una programación para el PRM. La ventana de programación se puede modificar en Configuración| Configuración del péptido mediante la pestaña Predicción, cambiando la ventana de tiempo.</li>
		<li>Ahora se puede exportar una lista de inclusión programada mediante Archivo| Exportación| Lista de aislamiento y selección del tipo de instrumento adecuado y el tipo de método de configuración en Scheduled.</li>
	</ol></li>
	<li>Analice los datos.<ol>
<li>Importe los ejemplos de la misma manera que para el análisis de ejecución de programación en la sección 4.2.</li>
		<li>Después de la importación completa de todas las muestras, se recomienda la curación de transiciones. Este es el proceso mediante el cual se eliminan las transiciones con interferencias o relaciones señal-ruido deficientes. En la figura 4se muestra un ejemplo de cromatograma antes y después de la curación.</li>
		<li>Los datos ahora se pueden exportar haciendo clic con el botón derecho en los gráficos relevantes y seleccionando Copiar datos o seleccionando Archivo| Exportación| Resultados.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Los autores no declaran intereses en competencia.

El análisis del estado de ubiquitina dentro de un proteoma es de creciente importancia para una amplia variedad de cuestiones biológicas. La descripción del estado de ubiquitinación de una muestra debe centrarse no sólo en el perfil de las proteínas que se ubicuan, sino también en la topología de dicha ubiquitinación. La evaluación de esta topología por EM dirigida, como se describe aquí, tiene un papel en una amplia gama de investigaciones biológicas.
Debe entenderse que el proto...

La estrecha regulación de la función y estabilidad de las proteínas es de suma importancia, ya que son los principales impulsores del control fenotípico de la biología. La función de una proteína se construye a partir de dos componentes: su secuencia intrínsa de polipéptidos y cualquier modificación posttranslacional (PTM). Se han identificado varios PTMs químicos, incluyendo glicosilación, fosforilación, acetilación y metilación1. En 1975, Goldstein et al.2 identificaron una pequeña proteína y la llamaron ubiquitina debido a su naturaleza omnipresente. Se encontró que la ubiquitina era importante en la degradación deproteínas 3. Sin embargo, desde entonces se ha establecido que la función de la ubiquitina como molécula de señalización se extiende mucho más allá de la regulación de la estabilidad de las proteínas. La señalización de ubiquitina participa en una amplia gama de otras funciones biológicas, como la estabilización de proteínas, la autofagia, el control del ciclo celular y el tráfico de proteínas4.
Mientras que otros PTMs son generalmente binarios (es decir, la proteína se modifica o se deja sin modificar) para un sitio dado, la ubiquitina puede modificar una proteína tanto como monómero como como una cadena polimérica, con la ubiquitina adjunta en sí siendo ubiquitina. Además, esta cadena de poliubiquitinación puede desarrollarse en varias topologías con la ubiquitinación de la ubiquitina anterior que se une a uno de los ocho sitios de eslabones5,6. La ubiquitina se transfiere mediante un proceso enzimático multipaso(Figura 1)donde la C-terminus de ubiquitina está vinculada a uno de sus siete residuos de lisina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 o K63) o al N-terminal de la ubiquitina anterior (denominada ubiquitina M1 o lineal)5,6. Esta topología de cadena es clave para el destino de la proteína bajo modificación. Por ejemplo, la modificación con una cadena vinculada K48 o K11 conduce a la degradación de la proteína modificada en el proteasoma, mientras que una cadena lineal es necesaria para la activación de la señalización NF-kB. Por lo tanto, la distribución relativa de estas topologías de cadena es relevante para una amplia variedad de cuestiones biológicas.
El uso de espectrometría de masas (EM) es de particular beneficio para el análisis de topología de cadena de ubiquitina, ya que no depende de interacciones basadas en anticuerpos o basadas en afinidad7,8, muchas de las cuales tienen una especificidad limitada y no diferencian entre los distintos tipos de cadena. Una posibilidad de detección diferente es el uso de mutantes de ubiquitina genéticamente modificados. Aquí, una lisina específica se intercambia por arginina, que no puede soportar la modificación por ubiquitina. La falta de formación de cadena de ubiquitina en la proteína del sustrato se interpreta entonces como evidencia de una topología específica9.
La identificación basada en EM de proteínas ubiquitinadas se basa en el hecho de que la C-terminus de ubiquitina contiene un residuo de arginina en la posición 74 que es reconocido por la trippsina durante la preparación proteótica de las muestras para el análisis de EM, separando el doble glicina C-terminal. Este GlyGly (-GG) permanece unido al grupo ε-amino de los residuos de lisina de la proteína del sustrato. Para el análisis de topología de ubiquitina, la modificación se produce en uno de los siete residuos de lisina de ubiquitina. Esto crea un conjunto de siete péptidos clave que llevan un residuo de lisina modificado por GG, específico para cada una de las topologías (Figura 2). Por ejemplo, con la topología K06, la lisina en la posición 6 en la secuencia de aminoácidos estará protegida de la digestión tríptica con una modificación -GG de 114 Da añadida a esta lisina.
La identificación de péptidos predeterminados específicos por EM se conoce como proteómica dirigida, o más específicamente, adquisición de péptidos dirigidos10. Se han desarrollado dos métodos dependiendo del rendimiento del espectrómetro de masas que se está utilizando. Estos son monitoreo de reacción seleccionado (SRM), también llamado monitoreo de reacción múltiple (MRM), y monitoreo de reacción paralelo (PRM). SRM implica la selección de transiciones que consisten en el precursor m/z y el producto iónico m/z. Por el contrario, PRM requiere sólo el precursor m/z. Después de la selección, se realiza un análisis completo de la encuesta de los iones del producto. Esto tiene la ventaja de que no es necesaria ninguna selección de iones de producto adecuados para la cuantificación en el espectrómetro de masa específico antes de la medición11. Tanto SRM como PRM pueden, dependiendo del instrumento, ser programados. La programación es la práctica de asignar una ventana de tiempo durante la cual se incluirá un ión determinado para su análisis, ya que los péptidos se eluden en los momentos de retención definidos del sistema cromatógráfico. Reducir el número de iones que se interroguen en un momento dado aumenta la frecuencia de interrogatorio de esos iones programados en ese momento, mejorando así la precisión de los datos.
En general, la aplicación de proteómica dirigida para la topología de ubiquitina es la misma que cualquier otro experimento proteómico dirigido. Sin embargo, dos diferencias clave son importantes: En primer lugar, debe considerarse la estabilidad de las cadenas de ubiquitina. Hay múltiples enzimas desubiquitinantes potentes (DUB) que degradan rápidamente las cadenas sobre la lisis celular. Los proteases específicos de la ubiquitina se dividen en dos categorías, las tioesteras y las metaloproteases. La mayoría de las ubiquitina-hidrolasas son tioesteras y transportan un residuo de cisteína en su centro activo. Al alquilar estos residuos de cisteína, se pueden desactivar. Como tal, el uso de búferes de estabilización de ubiquitina que contienen agentes alquilantes, como N-ethylmaleimide (NEM), y productos químicos altamente desnaturalizadores, y mantener las muestras frías es vital para un análisis exitoso. En segundo lugar, a diferencia de otros experimentos dirigidos, la elección del péptido es fija. En un experimento dirigido típico, se puede seleccionar un péptido proteotípico para un buen rendimiento cromatómico e ionización. Para algunos péptidos de características de topología como K48 estas propiedades son buenas, mientras que para otros, son menos deseables. Por ejemplo, la cromatografía K33 en una configuración típica en fase inversa es deficiente debido a la formación de un perfil de elución estirado, y las malas propiedades de ionización del péptido K27 reducen su visibilidad en MS12.
En este protocolo, describimos cómo realizar la evaluación de topología de ubiquitina de una muestra biológica por PRM. Los datos de ejemplo para el procedimiento se presentan utilizando una perturbación del proteasoma utilizando el tratamiento inhibidor de MG-132 en varios tipos de células diferentes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide (CAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy Peptides</td>
			<td>JPT Peptide Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ulitimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q-Exactive Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide (NEM)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>156100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K48</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K63</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-340-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain M1</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-710B-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier</td>
			<td>Branson sonifier</td>
			<td>SFX 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigam</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V1511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters &#956;Elution C18 plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002318</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

La evaluación del perfil global de las topologías de la cadena de ubiquitina dentro de un proteoma es de interés para responder a una amplia gama de preguntas biológicas. El protocolo descrito aquí aprovecha la modificación di-glicina (-GG) que queda después de la digestión tríptica de ubiquitina incorporada en una cadena. Al cuantificar estos péptidos de topología-característica se puede determinar la abundancia relativa de cada topología de cadena de ubiquitina. Los pasos necesarios para cuantificar estos péptidos mediante un experimento paralelo de monitoreo de reacciones se informan teniendo en cuenta la estabilización de las cadenas de ubiquitina. La preparación de controles pesados, lisis celular y digestión se describen junto con el flujo de trabajo adecuado de configuración de espectrómetros de masas y análisis de datos. Se presenta un conjunto de datos de ejemplo con perturbaciones en la topología de ubiquitina, acompañado de ejemplos de cómo la optimización del protocolo puede afectar a los resultados. Siguiendo los pasos descritos, un usuario podrá realizar una evaluación global del panorama de la topología de ubiquitina dentro de su contexto biológico.

Para demostrar el uso de un análisis de cadena de ubiquitina por PRM, se seleccionaron tres líneas celulares: una línea de células de melanoma de ratón B16, y las dos líneas celulares humanas comunes A549 (células epiteliales basales adenocarcinomicas alveolar) y HeLa (células cancerosas cervicales). Estos cultivos crecieron a fase midexponential en medios apropiados antes de ser tratados con 0, 10 o 100 mM MG-132 durante 4 h antes de la cosecha. MG-132 es un inhibidor del proteasoma que previene la degradación ...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.

Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.4K vistas.  Luxembourg Institute of Health. Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.

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2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Investigación

Bioquímica

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament on single-stranded DNA (ssDNA) and captures double-stranded DNA (dsDNA) non-specifically to interrogate it for a homologous sequence. After encountering homology, Rad51 catalyzes DNA strand exchange to mediate pairing of the ssDNA with the complementary strand of the dsDNA. This reaction is highly regulated by numerous accessary proteins in vivo. Although conventional biochemical assays have been successfully employed to examine the role of such accessory protein in vitro, kinetic analysis of intermediate formation and its progression into a final product has proven challenging due to the unstable and transient nature of the reaction intermediates. To observe these reaction steps directly in solution, fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based real-time observation systems of this reaction were established. Kinetic analysis of real-time observations shows that the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 obeys a three-step reaction model involving the formation of a three-strand DNA intermediate, maturation of this intermediate, and the release of ssDNA from the mature intermediate. The Swi5-Sfr1 complex, an accessary protein conserved in eukaryotes, strongly enhances the second and third steps of this reaction. The FRET-based assays presented here enable us to uncover the molecular mechanisms through which recombination accessary proteins stimulate the DNA strand exchange activity of Rad51. The primary goal of this protocol is to enhance the repertoire of techniques available to researchers in the field of homologous recombination, particularly those working with proteins from species other than Schizosaccharomyces pombe, so that the evolutionary conservation of the findings presented herein can be determined.

Fluorescence resonance energy transfer-based real-time observation systems of the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 were developed. Using the protocols presented here, we are able to detect the formation of reaction intermediates and their conversion into products, while also analyzing the enzymatic kinetics of the reaction.

Observación en tiempo real de la reacción de intercambio de filamento de ADN mediada por Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Híbrido claro/azul electroforesis nativa para la separación y análisis de Supercomplejos de cadenas respiratorias mitocondriales

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

Perfiles de Complexome de Alta Resolución por Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

Caracterización funcional de las ligasinas de ubiquitina RING-Tipo E3 In Vitro y In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and atherosclerosis. Although there are several methods for analyzing plasma lipoproteins, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Because of its intact separation procedure, the lipoprotein fractions isolated by this method can be used for analysis of lipoproteins, apolipoproteins, proteomes, and functional study of lipoproteins with cultured cells in vitro. Here, we provide a detailed protocol to isolate seven lipoprotein fractions including VLDL (d&#60;1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 and 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, and 1.21 g/mL) from rabbit plasma using sequential floating ultracentrifugation. In addition, we introduce the readers how to analyze apolipoproteins such as apoA-I, apoB, and apoE by SDS-PAGE and Western blotting and show representative results of lipoprotein and apolipoprotein profiles using hyperlipidemic rabbit models. This method can become a standard protocol for both clinicians and basic scientists to analyze lipoprotein functions.

Several methods have been used for analyzing plasma lipoproteins; however, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Here, we describe a method regarding how to isolate lipoproteins from plasma using sequential density ultracentrifugation and how to analyze the apolipoproteins for both diagnostic and research purposes.

Aislamiento y análisis de lipoproteínas plasmáticas por ultracentrifugación

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.