El método clásico en el que se extraen proteínas de membrana para su estudio es por simple solubilización en detergente. Si bien esto proporciona un método simple y universal, se ha demostrado que los detergentes alteran la estructura, función y actividad nativas de estas proteínas sensibles. Aquí presentamos el Peptidisc como una solución para estabilizar las proteínas de membrana en solución libre de detergente.
El sistema Peptidisc se adapta espontáneamente al tamaño, la forma y la tipología de innumerables proteínas de membrana. Esto contrasta con otros miméticos de membrana que a menudo requieren una optimización tediosa. FhuA, una proteína de membrana externa de E.coli, se utilizará como proteína objetivo modelo que se reconstituirá en este protocolo.
Las vesículas de membrana externa se aislarán seguidas de la adición de detergente para solubilizar las proteínas de la membrana. El péptido Peptidisc se añade a la solubilización y el detergente se diluye, formando espontáneamente partículas Peptidisc. Estas partículas solubles estabilizadas ahora son susceptibles de numerosas aplicaciones posteriores.
Este protocolo examinará la interferometría de capa biológica como una aplicación de la tecnología Peptidisc. Este protocolo se centrará en el método de reconstitución PeptiQuick, una técnica útil que facilita la purificación y reconstitución simultánea de proteínas de membrana. El método PeptiQuick de reconstitución en las perlas se realiza en una columna de gravedad IMAC estándar de níquel-NTA preequilibrada en detergente.
La membrana solubilizada se carga sobre la resina y las proteínas no objetivo se lavan. Después de que este péptido se añade a la columna y el detergente se diluye rápidamente. El lado hidrófobo del péptido Peptidisc se asocia con las regiones hidrofóbicas expuestas.
El lado hidrófilo del péptido mantiene la proteína soluble en solución. El exceso de péptido se lava. El imidazol se añade para eluir la furia reconstituida.
El andamio Peptidisc puede ser funcionalizado para etiquetar indirectamente las proteínas de la memoria y así abrir la puerta a un conjunto más amplio de análisis aguas abajo. Aquí explotamos el péptido biotinilado para la fijación a los sensores recubiertos de estreptavidina para el análisis BLI. La interferometría de capa biológica es una potente técnica libre de etiquetas para investigar interacciones biomoleculares en solución.
Además de demostrar simplemente las interacciones, esta técnica proporciona una lectura cinética en tiempo real y permite el cálculo de una constante de disociación vinculante. A través de este protocolo, eliminamos la necesidad de detergente durante el análisis BLI, ya que esto puede alterar la actividad. La interferometría de biocapa analiza el paso de interferencia de la luz blanca reflejada desde el sensor, o punta, y las macromolas enlazadas durante una interacción.
Para medir las interacciones, la punta de detección se pasa entre las soluciones y la señal registrada en cada paso. Cada punta entonces da su propio rastro en un sensograma. En primer lugar, solo se establece una línea base de búfer.
Segundo, el ligando está atado. En este caso, FhuA y Peptidiscs biotinilo se une a una punta revestida de estreptavidina. A continuación, la punta se lava en el búfer para eliminar cualquier FhuA sin enlazar.
Ahora la punta se mueve a una solución con una concentración conocida de analito, aquí ColM. Si se produce una interacción, esto dará una curva de enlace. Finalmente, la punta se mueve al búfer y se mide la disociación.
Las tasas observadas para la asociación y la disociación en cada concentración de columna se pueden utilizar para calcular la constante de disociación. Hexahistidina etiquetada FhuA se expresa en E-coli cepa AW740 durante 18 horas en medios de comunicación. Las bacterias se cosechan por centrifugación a 5.000 G de 10 minutos a cuatro grados centígrados.
El pellet celular resultante se vuelve a suspender en el búfer TSG y luego se descuesta para romper los grumos celulares y asegurar la lysis a fondo. TMSF se añade a las células re-suspendidas a una concentración final de un milimolar justo antes de la lelisis. La lysis celular se logra mediante tres pasajes a través de un microfluidizador a 15.000 PSI o una prensa francesa a 8.000 PSI.
Las células de lesed se recogen y se realiza una centrifugación a baja velocidad a 5.000 G durante 10 minutos a cuatro grados. Un sobrenadante del giro a velocidad lenta se carga en un rotor ultracentrífuga TI70 y se centrifuga a 200.000 G durante 40 minutos a cuatro grados para peletizar la membrana bruta de E.coli. Después de la ultracentrifugación, el sobrenadante se desecha y el pellet de membrana bruta se re-suspende en una cantidad mínima de tampón TSG.
Una membrana bruta se dounced para asegurar su homogeneidad. Se realiza un ensayo de Bradford para comprobar la concentración proteica de la membrana bruta re-suspendida. TSG buffer se utiliza para diluir la membrana bruta a aproximadamente tres miligramos por mililitro antes de la solubilización.
Tritón X-100 se añade a la membrana bruta re-suspendida a una concentración final del 1%para solubilizar selectivamente la membrana interna bacteriana. La solubilización se realiza durante una hora a cuatro grados, con un suave balanceo. La membrana externa no solubilizada se aísla por ultracentrifugación a 200.000 G durante 40 minutos, a cuatro grados.
Se descarta el sobrenadante resultante que contiene la membrana interna solubilizada. Mientras que el pellet, que contiene la membrana externa, se re-suspende como antes en TSG. LDAO se añade a una concentración final del 1% a la membrana externa re-suspendida, y se solubiliza durante una hora a cuatro grados.
Finalmente, se realiza una ultracentrifugación, como antes, para peletizar material insoluble. El sobrenadante resultante contiene membrana externa solubilizada, incluyendo nuestro objetivo, su objetivo, el FhuA, ahora listo para la purificación simultánea de IMAC y la reconstitución de Peptidisc. Una columna de gravedad IMAC de Níquel-NTA se preequilita con dos volúmenes de columna de tampón de lavado IMAC.
El imidazol se añade a una concentración final de cinco mililitros a la membrana exterior solubilizada, diluida a 0,04%LDAO. La membrana externa solubilizada se carga sobre la resina de níquel-NTA, y el flujo a través de recolectar. Este flujo a través se recarga sobre la resina para aumentar la unión de resina de FhuA.
Después de la carga, la resina se lava con 250 mililitros de tampón de lavado IMAC y los primeros 50 mililitros recogidos. Después del lavado, el tampón de lavado se drena justo por encima de la altura del lecho de resina y el tapón de columna cerrado. Un mililitro de concentrado, 10 miligramos por mililitro, péptido Peptidisc se añade a la columna.
Después de la adición de péptido concentrado, 50 mililitros de diluir, un miligramo por mililitro, se añade péptido Peptidisc en TSG. La resina se agita para volver a suspender las perlas en TSG, por debajo del CMC de LDAO, formando así partículas Peptidisc. Después de la captura de Peptidisc, la resina se deja asentar y la solución de péptido de un miligramo por mililitro se drena a través de la resina.
La resina se lava con 50 mililitros TSG para eliminar el exceso de péptido Peptidisc. Finalmente, las partículas De Peptidisc se diluyen con 50 mililitros de 600 imidazol mililolar en TSG. Se recogen fracciones de un mililitro y se añaden 10 microlitros de 0,5 molares EDTA, una luz clave lixiviada iones de níquel.
Las fracciones de inicio, flujo, lavado y eludido se cargan en un gel 12%SDS y se electroforezan durante 30 minutos a 60 miliamperios. El gel se tiñe y se visualiza en un escáner de gel. El gel resultante muestra el agotamiento de FhuA en el flujo a través, y el enriquecimiento en la elución.
También se observan bandas contaminantes menores en las fracciones eludidas. Las fracciones tres a siete se seleccionan para la cromatografía de exclusión de tamaño para confirmar la solubilidad de FhuA Peptidisc y agotar los contaminantes. Un concentrador centrífugo de 30 Kilodome cortado se utiliza para concentrar las fracciones de tres a siete.
Un mililitro de las fracciones de elusión IMAC agrupadas se inyecta en la columna S200 a un caudal de 0,25 mililitros por minuto en el búfer TSG. Se recogen fracciones de un mililitro y se ejecuta un gel 12%SDS de las fracciones. Las fracciones relevantes se agrupan y ahora se pueden utilizar en aplicaciones posteriores.
BLI se llevó a cabo en un octeto ForteBio RED96. Este instrumento mueve los pines BLI a través de una placa de 96 pozos que se configura primero a mano. Todos los pozos se llenan hasta un volumen final de 200 microlitros.
La columna uno se carga con búfer cinético para permitir que las puntas se equilibren y formen una señal de línea de base. La columna dos se carga con una concentración predeterminada del búfer de ligando y cinética. En este caso, FhuA es el ligando, y se añade a la concentración de 2,5 microgramos por mililitro.
La punta de la fila E se utilizará como referencia y se cargará solo con búfer. La columna tres está cargada con tampón cinético para lavar el exceso de FhuA de la punta. Dos diluciones seriales dobles del analito, en este caso ColM, se cargan de arriba a abajo en la columna cuatro.
La más alta de estas concentraciones se utiliza para la fila de referencia, para medir la unión no específica del analito a la punta. La columna cinco se carga con el búfer. Aquí, el ColM se disociará, y la disociación se mide.
Una vez preparada la placa, la bandeja de la punta del sensor y la placa preparada se cargan en el instrumento BLI. Se abre el software de adquisición de datos BLI y se inicia un nuevo experimento cinético. La pestaña Definición de placa se utiliza para introducir el diseño de la placa de 96 pozos en el software.
Aquí el ligando FhuA se introduce como la carga mientras que el analito ColM se introduce como la muestra. La pestaña Definición de ensayo se utiliza para definir la longitud de tiempo y la velocidad de rotación de la placa para cada paso del experimento. Aquí incluimos un paso de línea de base de 60 segundos, seguido de un paso de carga de 250 segundos, un segundo paso de línea base de 300 segundos, un paso de asociación de analito de 450 segundos y, finalmente, un paso de disociación de 900 segundos.
Estos pasos se asignan individualmente a cada columna de la placa de 96 pozos seleccionando el paso deseado y haciendo clic con el botón derecho en Agregar ensayo en cada columna. La pestaña de asignación del sensor se utiliza para asegurarse de que el instrumento Octet está tomando pines BLI de su ubicación correcta en la bandeja del sensor. La pestaña Revisar experimento proporciona una visión general final del experimento, antes de ejecutarse.
BLI ahora será llevado a cabo por el Octeto RED. Esto producirá un sensograma de datos sin procesar para su análisis. El análisis se realiza abriendo primero el software de análisis de biodatos Octet.
La pestaña Selección de datos se utiliza para localizar el experimento y comprobar el resumen experimental. Las concentraciones del analito ColM se introducen aquí. A continuación, se utiliza la pestaña Procesamiento para restar la señal de referencia de los datos experimentales.
La línea de base se define para alinear el eje Y como si se aplicara su tasa de desaleción. Por último, se selecciona Procesar datos. Los datos se aíslan para este experimento y se selecciona Ajustar curvas.
Se elige un ajuste parcial de la curva de asociación y disociación. El Kd se calcula a partir de este accesorio. El cromatograma de exclusión de tamaño se utiliza para validar la reconstitución delambute.
El cromatograma muestra un único pico simétrico, lo que sugiere una preparación de proteína monodispersa. El pico elue varios mililitros después del volumen vacío, lo que indica partículas Peptidisc solubles no agregadas. Los agregados proteicos se elurán al volumen vacío, mientras que el exceso de detergentes y péptidos se elurán después del pico principal.
El aumento del lavado de los Peptidiscs formados mientras que todavía unido a las cuentas de níquel-NTA debe agotar este último pico. Los agregados proteicos son a menudo el resultado de exponer las proteínas de la memoria a la solución libre de detergente antes de la reconstitución. Este cromatograma de última exclusión es un diagnóstico útil para solucionar la reconstitución de uno.
Tras el procesamiento de los datos experimentales, se ajusta una curva al sensograma. La precisión de este accesorio es esencial para el cálculo de la constante de disociación. La gráfica de vista residual describe la diferencia entre los datos experimentales y el ajuste computacional.
Esto muestra que para las cuatro concentraciones de columna diferentes tres de las curvas encajan bien. Sin embargo, para la mayor concentración la curva no produce un buen ajuste. Esto sugiere que en esta concentración más alta, hay unión heterogénea de la columna al pin.
Por lo tanto, esta señal de concentración más alta no se incluye en el análisis cinético según las notas de aplicación de ForteBio. Las tres curvas restantes se utilizan para el análisis cinético. Una constante de disociación entre FhuA y ColM, determinada mediante el método BLI y Peptidisc, es coherente con las constantes determinadas por otros métodos.
La calorimetría isotérmica y los nanodiscos, y la termoforesis a microescala y Peptidisc arrojaron constantes de disociación no significativamente diferentes de nuestro valor determinado. Esta consistencia valida el método Peptidisc BLI para medir la cinética de interacción. Muy bien, entonces, después de ver este video, esperamos que haya obtenido una comprensión práctica de la fuerza y la advertencia de los métodos PeptiQuick.
Hemos encontrado este método particularmente útil para cuantificar la interacción FhuA ColM en ausencia completa de detergentes. Y sospechamos que el mismo flujo de trabajo se puede aplicar para caracterizar cualquier otra interacción receptor-ligand. Buena suerte con tus experimentos.
