La inmunofluorescencia CL3 permite la determinación de los niveles de autofagia en las células pancreáticas. Permite estudiar los efectos potenciales de diferentes agentes sobre la autofagia de las células pancreáticas. La inmunofluorescencia es una técnica utilizada para detectar la proteína CL3 endógena, que evita los problemas causados por la sobreexpresión de CL3, como la formación de agregados de proteínas no relacionados con la autofagia.
Demostrando el procedimiento estarán Felipe Renna, graduado de doctorado, y Malena Herrera López, estudiante de doctorado del laboratorio de María Inés Vaccaro. Para comenzar la preparación de la celda, remoje los resbalones de cubierta redonda de 12 milímetros en etanol absoluto. Después de quitar la cubierta, coloque el deslizamiento de la cubierta empapado verticalmente en la placa de 24 pocillos.
Exponga la placa de pocillos múltiples a la radiación ultravioleta durante 15 minutos. Luego coloque el cubreobjetos horizontalmente y lávelo con DMEM. Ahora vea el bajo número de paso de células pancreáticas, resuspendidas en DMEM, que contienen 10% FBS, penicilina y estreptomicina, e incube las células durante dos días.
Dos días después de la siembra celular, prepare la solución de gemcitabina en DMEM a un microgramo por concentración de microlitro. Luego aspire la mitad del volumen de cada pocillo en un tubo separado y agregue la cantidad adecuada de solución de gemcitabina. Devolver la mitad del volumen correspondiente a cada pocillo a los pocillos tratados e incubar las células durante 24 horas.
Para fijar y permeabilizar las células, agregue metanol frío en una placa de 24 pocillos que contenga células. También prepare un plato de seis pocillos con PBS frío. Usando una aguja de jeringa y pinzas, tome cada hoja de cubierta y lávela dos veces en PBS.
Luego incubar en metanol durante seis minutos. Después de lavar dos veces con PBS, incubar los cubos de la cubierta en una solución de bloqueo durante una hora. Agregue un anti LC3 en la solución de bloqueo en una proporción de uno a 1000, y manténgalo en hielo.
Coloque un trozo de película de sellado de laboratorio sobre la tapa de varios pocillos y agregue 25 microlitros de solución anti-LC3 por cubreobjetos sobre la película de sellado. Usando una aguja de jeringa y pinzas, coloque cada cubierta sobre la gota de anticuerpos primarios, asegurándose de que el lado celular esté en contacto con la solución. Coloque la placa de varios pocillos en la cámara de humedad.
Cúbralo con papel de aluminio e incube durante la noche en la nevera. Al día siguiente, retire la placa de pocillos múltiples de la cámara de humedad. Coloque los resbalones de la cubierta en la placa de varios pocillos y lávelos con PBS tres veces.
Diluya el anti-conejo marcado con fluorescencia en una solución de bloqueo en una proporción de uno a 800, y manténgalo en hielo en la oscuridad. Después de sellar la tapa de pocillos múltiples, agregue 25 microlitros de solución anticonejo por cubrebacabezas sobre la película de sellado. Y trate el deslizamiento de la cubierta con un anticuerpo secundario como se demostró anteriormente.
Luego incubar la placa en la cámara de humedad durante dos horas a temperatura ambiente, protegida de la luz. Al final de la incubación con anticuerpos, lave las hojas de cubierta en la placa de pocillos múltiples con PBS tres veces. Incubar cada cuba con la solución DAPI preparada durante 10 minutos.
Una vez lavado con PBS, mantenga la placa de múltiples pocillos en la oscuridad. Para el montaje celular, prepare dos vasos de precipitados con agua y un pedazo de papel. Agregue 10 microlitros de solución de PVA-DABCO por cubreobjetos en un portaobjetos.
Lave la cubierta en agua y luego séquela en papel. Finalmente, colóquelo sobre la gota PVA-DABCO. Y secar durante la noche en la oscuridad.
Al día siguiente, utilizando un microscopio confocal invertido, visualice las células marcadas y capture las imágenes. Después de capturar imágenes, arrastre y suelte cada archivo de imagen que contenga los canales capturados en la pantalla de Fiji. En el cuadro de diálogo, haga clic en Aceptar para abrir la imagen.
A continuación, cierre la ventana de consola abierta. En la pestaña Imagen, seleccione Color y, a continuación, Dividir canales. Cierre la imagen correspondiente a los canales distintos de la imagen LC3.
Luego, en la pestaña Imagen, seleccione Ajustar, seguido de Balance de color. Mueva el control deslizante máximo hacia la izquierda hasta que la imagen se sature para visualizar los contornos de la celda. Utilice la herramienta de selección a mano alzada para dibujar el contorno de la celda y haga clic en restablecer para ajustar los colores.
Para cortar el elemento seleccionado en la ficha Editar, seleccione Cortar y cierre la imagen sin guardarla. Y en la pestaña Editar, seleccione pegar. En el menú Analizar, elija la herramienta Contador de objetos 3D.
Establezca el umbral en 2000 y el filtro de tamaño en 50 a 500. Asegúrese de que los objetos y los cuadros de resumen estén marcados, y haga clic en OK.In la ventana de registro, el número de puntos se describirá como objetos detectados. La inmunofluorescencia indicó la distribución celular de la proteína LC3, mientras que el DAPI mostró localización nuclear en las células pancreáticas.
Los puntos CL3 aumentaron significativamente bajo el tratamiento con gemcitabina, lo que indica actividad autofágica. Bajo una confluencia excesiva, las células exocrinas del páncreas tienden a acumularse y crecer una encima de la otra. El método de fijación de células de paraformaldehído fue ineficaz para preservar las proteínas LC3, ya que no reflejaba una distribución precisa.
Cuando la fijación o el tratamiento se realizó sin esperar dos días después de la siembra, las células PANC1 tenían una forma redonda. Esta morfología disminuyó la relación entre el citoplasma y el núcleo, dificultando la comprensión de la distribución intracelular de la CL3. La fijación incompleta de metanol podría interferir con el inmunoetiquetado adecuado de LC3, lo que daría lugar a imágenes poco claras y a una cuantificación subóptima.
Lo más importante que debe recordar durante este procedimiento es que las células deben fijarse en metanol frío durante seis minutos, en lugar de paraformaldehído. Tras este procedimiento, se puede analizar la colocalización entre CL3 y otras proteínas, permitiendo el estudio de diferentes vías moleculares relacionadas con las funciones de LC3.
