Los autores agradecen a Robert Schuster por su ayuda con la verificación de datos.

El flujo de trabajo de alto nivel para mAbScale se muestra en la figura 2. Cada paso tiene ramas de decisión internas, bucles y combinatoria más sofisticados. En la Figura complementaria 1 se presenta un flujo de trabajo algorítmico detallado que describe el proceso de cálculo. La salida de la aplicación se guarda en formato de hoja de cálculo en la carpeta seleccionada por el usuario. El archivo de salida consta de varias hojas de cálculo independientes, que se pueden clasificar como la entrada del usuario, los cálculos de peso molecular y las referencias para las derivaciones de masa isotópica promedio (se proporciona un ejemplo de salida en tablas complementarias). Las hojas de trabajo de entrada del usuario incluyen las secuencias de aminoácidos de proteínas y otra información ingresada por el usuario, masas elementales promediadas y masas de glicanos, que se utilizan para calcular la composición elemental y los diferentes pesos moleculares. Las hojas de cálculo de peso molecular incluyen la composición química de varias formas, la masa reducida con y sin glicosilación y modificación química, y la masa intacta con y sin glicosilación y modificación química. Las hojas que contienen masas de medios anticuerpos se generarán automáticamente si el usuario ingresa dos HC diferentes y/o dos LC diferentes en la página de entrada del usuario, ya que los medios anticuerpos son impurezas primarias que deben identificarse y cuantificarse en relación con el heterodímero deseado. Se puede acceder al código fuente de mAbScale a través del siguiente repositorio: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig02.jpg"> Figura 2: Resumen de los pasos involucrados en el cálculo de composiciones elementales y masas utilizando la aplicación. El código de colores se puede utilizar para vincular el flujo de proceso descrito en la Figura complementaria 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1. Abrir la aplicación mAbscale
<ol><li>Abra la aplicación de software haciendo doble clic en el icono del archivo ejecutable.</li>
</ol>2. Entrada de secuencia
<ol><li>Introduzca las secuencias de cadenas pesadas y ligeras en los respectivos cuadros de texto marcados con 1 sin espacios.<ol><li>Para bsAbs, agregue cadenas pesadas o ligeras adicionales en el segundo conjunto de cuadros de texto marcados con 2. Deje 2 en blanco para los mAbs con cadenas pesadas y cadenas ligeras idénticas.</li>
		<li>Marque las casillas de verificación Ciclación de N-terminal y/o Recorte de terminal C , si estas variantes de terminales de cadena pesada son aplicables.</li>
		<li>Agregue cualquier modificación química, incluido el enlazador y la carga útil para las moléculas ADC, a los cuadros de texto Heavy Chain Chem Mod y/o Light Chain Chem Mod .<ol><li>Especifique las modificaciones como composiciones elementales, como CaCl2. La modificación se agregará a la subunidad o cadena de proteína respectiva. NOTA: También se puede restar una composición química de una subunidad o cadena prefijando la composición elemental con un signo -. Por ejemplo, -H2O restará una molécula de agua de la composición y masa de la subunidad.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Especificación del número de enlaces disulfuro
<ol><li>Especifique el número de enlaces disulfuro en las moléculas de proteína en el cuadro de texto marcado Número total de disulfuros.</li>
	<li>Introduzca el número de disulfuros de HC no reducidos en el cuadro de texto Disulfuros de HC no reducidos y el número de disulfuros de HC no reducidos en el cuadro de texto Disulfuros de HC no reducidos , en función del grado de reducción (completa o parcial). NOTA: El análisis de masa reducida de las subunidades de mAb implica la reducción/separación de las cadenas pesadas y ligeras ligadas al disulfuro.</li>
	<li>Si la glicosilación está presente en la cadena ligera de anticuerpos monoclonales, marque la casilla de verificación La cadena ligera está glicosilada .</li>
</ol>4. Configuración de la carpeta de salida y ejecución de la aplicación
<ol><li>Haga clic en el botón Examinar para seleccionar una carpeta de salida para el cuadro de texto Carpeta de salida .</li>
	<li>Introduzca el nombre del archivo de salida sin una extensión de archivo (se guarda automáticamente como .xlsx) en el cuadro de texto Archivo de Excel (sin ext). </li>
	<li>Haga clic en el botón Enviar para iniciar la solicitud. El archivo de salida se puede encontrar en la carpeta designada. NOTA: Las masas elementales y la lista de glicanos se pueden personalizar editando los archivos de texto delimitados Element_Mass.csv (Archivo de codificación suplementaria 1) y Glicano.csv (Archivo de codificación suplementaria 2), respectivamente. Estos archivos deben colocarse en la misma carpeta que el archivo ejecutable mAbScale.exe (archivo de codificación suplementario 3) para que se ejecute la aplicación. La aplicación se cerrará automáticamente después de una ejecución. El usuario tendrá que volver a iniciar la aplicación si necesita un segundo cálculo.</li>
</ol>

Una herramienta basada en Python para el cálculo preciso de la masa de entidades bioterapéuticas

<ol>
	<li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics.">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li><li>Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+for+developing+next-generation+protein+therapeutics+for+cancer+treatment.">Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).</li><li>Wang, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+biology,+and+structure-based+therapeutics+development.">SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline">https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline</a> (2018)</li><li>Donnelly, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+and+benchmarks+for+intact+protein+analysis+for+top-down+mass+spectrometry.">Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry.</a> Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).</li><li>Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+mass+accuracy+of+high+performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+intact+antibodies.">Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).</li><li>Beck, A., Sanglier-Cianf&#233;rani, S., Van Dorsselaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosimilar,+biobetter,+and+next+generation+antibody+characterization+by+mass+spectrometry.">Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).</li><li>Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+LC-MS:+the+next+generation+characterization+of+antibody-based+therapeutics+by+unified+online+bottom-up,+middle-up+and+intact+approaches.">Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches.</a> Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).</li><li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+structures+of+IgG+molecules.">Disulfide bond structures of IgG molecules.</a> mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li><li>Jakes, C., F&#252;ssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+biotherapeutics+using+protein+a+chromatography+coupled+to+orbitrap+mass+spectrometry.">Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).</li><li>Robotham, A. C., Kelly, J. F., Matte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+-+LC-MS+characterization+of+antibody-based+therapeutics:+Recent+highlights+and+future+prospects.">Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects.</a> Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics. , 1-33 (2020).</li><li>Valeja, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+mass+baseline+resolution+for+an+intact+148+kDa+therapeutic+monoclonal+antibody+by+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry.">Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).</li><li>Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+analysis+of+monoclonal+antibodies+with+electron+transfer+dissociation+orbitrap+fourier+transform+mass+spectrometry.">Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).</li><li>Berglund, M., Wieser, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopic+compositions+of+the+elements+2009+(IUPAC+Technical+Report).">Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report).</a> Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ame2012+atomic+mass+evaluation.">The Ame2012 atomic mass evaluation.</a> Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).</li><li>Peri, S., Steen, H., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPMAW--A+software+tool+for+analyzing+proteins+and+peptides.">GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).</li><li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry.">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).</li><li>De Leoz, M. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interlaboratory+study+on+glycosylation+analysis+of+monoclonal+antibodies:+Comparison+of+results+from+diverse+analytical+methods.">interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).</li><li>Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+monoclonal+antibody+N-glycosylation+-+Structure,+function+and+therapeutic+potential.">Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential.</a> Biologicals. 52, 1-11 (2018).</li><li>Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+site+localization+scoring+integrated+into+a+search+engine.">Modification site localization scoring integrated into a search engine.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).</li><li>Chalkley, R. J., Clauser, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+site+localization+scoring:+Strategies+and+performance.">Modification site localization scoring: Strategies and performance.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).</li></ol>

Este software se publica bajo la licencia Apache 2.0. Derechos de autor (2022) de GlaxoSmithKline Research & Development Limited. Todos los derechos reservados. Licenciado bajo la Licencia Apache, Versión 2.0 (la "Licencia"); no puede utilizar este archivo excepto en cumplimiento de la Licencia. Puede obtener una copia de la Licencia en http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. A menos que lo exija la ley aplicable o se acuerde por escrito, el software distribuido bajo la Licencia se distribuye "tal cual", sin garantías ni condiciones de ningún tipo, ya sean expresas o implícitas. Consulte la Licencia para conocer el idioma específico que rige los permisos y las limitaciones de la Licencia. L.C. es un empleado de GlaxoSmithKline (GSK). T.H. y K.K. desarrollaron este software como empleados de GSK y ahora son asociados de Merck y Moderna, respectivamente.

mAbScale proporciona una interfaz de usuario intuitiva con la flexibilidad de alterar los componentes básicos para los cálculos de masa y elementales. Se espera que los usuarios tengan un conocimiento básico de la molécula objetivo para usar la aplicación, derivar masas correctas e interpretar los resultados. Por ejemplo, la hoja de salida de masa intacta o reducida puede ser abrumadora debido a las numerosas filas de masas intactas o reducidas, ya que la base de datos de glicanos predeterminada contiene 88 glicanos...

En las últimas dos décadas, la bioterapéutica ha evolucionado hasta convertirse en un pilar de la industria farmacéutica moderna. La pandemia de SARS-CoV2 y otras afecciones potencialmente mortales han aumentado aún más la necesidad de un desarrollo más rápido y amplio de moléculas biofarmacéuticas 1,2,3.
El peso molecular bioterapéutico es crítico para la identificación de la molécula, en combinación con otros ensayos analíticos. Las masas de subunidades intactas y reducidas se utilizan a lo largo de los ciclos de vida de descubrimiento y desarrollo como parte de las estrategias de control destinadas a mantener la calidad, como se describe en el QTPP (Quality Target Product Profile)4.
El desarrollo analítico en la industria biofarmacéutica se basa en gran medida en las mediciones de masa para el análisis de masa intacta y la caracterización profunda mediante el mapeo de péptidos o el monitoreo del método multiatributo (MAM). En el centro de estas técnicas que utilizan plataformas modernas de espectrometría de masas (MS) se encuentra la capacidad de proporcionar mediciones de masa precisas de alta resolución (HR/AM). La mayoría de los instrumentos HR/AM producen precisiones de masa en el rango de 0,5-5 ppm, que se escalan con el rango de masa. La capacidad de medir masas con precisión para moléculas grandes intactas permite la identificación rápida y confiable de terapias de moléculas grandes. Dado que la resolución isotópica no puede alcanzarse utilizando las condiciones experimentales típicas para moléculas grandes (>10 kDa), se deben calcular las masas medias para su comparación e identificación 5,6.
Un espectro típico de masa de proteína intacta o subunidad representa el perfil proteoforme general, que contiene información compuesta sobre las diversas formas moleculares resultantes de las modificaciones postraduccionales (PTM) y cualquier diferencia de estructura primaria, como clips o variantes de secuencia. La naturaleza relativamente fácil y de alto rendimiento de estas mediciones las hace atractivas para la caracterización y como controles de monitoreo durante el proceso 7,8. El análisis de datos para estos experimentos generalmente requiere que el usuario defina el espacio de búsqueda de formas moleculares (rango de PTM u otras formas moleculares). En el caso de las proteínas glicosiladas, este espacio de búsqueda está impulsado en gran medida por la heterogeneidad de los glicoformes. Las combinaciones de múltiples PTM, las configuraciones de enlaces disulfuro y otras variaciones a lo largo de la estructura primaria hacen que el cálculo de todas las formas moleculares posibles sea una tarea tediosa. Por lo tanto, el cálculo manual de las posibles formas moleculares es un proceso que consume tiempo y recursos con un alto potencial de error humano.
Aquí, presentamos una herramienta de cálculo de masa que fue desarrollada considerando las características más importantes de las moléculas bioterapéuticas, tales como mAbs, bsAbs, ADCs, etc. La herramienta permite la fácil incorporación de variables de espacio de búsqueda para el cálculo consistente de masas y composiciones elementales. El carácter modular de esta herramienta permitirá seguir desarrollándola y aplicándola al cálculo de masas y a la adaptación de masas para otras modalidades.
El módulo GUI permite al usuario especificar la entrada para el cálculo de masa, como se muestra en la Figura 1; En concreto, el usuario introduce secuencias de aminoácidos de una sola letra para cadenas de anticuerpos ligeros y pesados. Las modificaciones comunes para la ciclación de N-terminal de cadena pesada y el recorte de lisina C-terminal se incluyen como casillas de verificación. Además, la fórmula química/composición elemental se puede agregar/restar de estas cadenas de proteínas a través del cuadro de texto Chem Mod respectivo. Esto permite al usuario la flexibilidad de agregar una composición elemental que incluye múltiples modificaciones postraduccionales o una carga útil de molécula pequeña en el caso de un ADC. Como la mayoría de los anticuerpos monoclonales terapéuticos están diseñados para eliminar los sitios de glicosilación en la cadena ligera, la glicosilación en la cadena ligera se deja opcional y se puede especificar mediante una casilla de verificación en la interfaz gráfica de usuario.
Una variación típica del análisis de masa intacta para anticuerpos es un análisis de masa de subunidades reducidas, en el que la cadena ligera se separa de la cadena pesada mediante la reducción de los enlaces disulfuro entre cadenas. Dependiendo de la fuerza del agente reductor utilizado, los enlaces disulfuro intracadena pueden o no escindirse. Los usuarios tienen la flexibilidad de introducir el número total de enlaces disulfuro en función del subtipo de IgG o en el caso de unADC 9 conjugado con cisteína.
La aplicación calcula las masas de forma ascendente, en la que las composiciones elementales se calculan primero para las cadenas pesadas y ligeras individuales. A continuación, se tiene en cuenta la ciclación N-terminal de cadena pesada (HC) Lys-clipping ajustando las composiciones elementales calculadas. A continuación, se aplican las modificaciones químicas especificadas a las cadenas pesadas y/o ligeras. Dependiendo del tipo de análisis y de los patrones de enlace disulfuro especificados por el usuario, el número de hidrógenos se ajusta para las dos cadenas polipeptídicas. Las masas de HC glicosilado y de cadena ligera (LC) (opcional) se calculan en función de la entrada del usuario. Finalmente, se combinan múltiples masas HC y LC, y los números de enlace disulfuro se actualizan automáticamente para el cálculo de masa intacta.
Con moléculas más grandes, como proteínas intactas, las masas monoisotópicas no se pueden medir debido al defecto de masa aditivo cuando se utilizan espectrómetros de masas con un poder de resolución típico. En cambio, se miden o informan masas nominales o promedio 5,10,11,12,13. Las masas elementales medias pueden variar en función de la fuente utilizada para las masas seleccionadas14,15. Si bien las diferencias en las masas elementales pueden ser pequeñas, pueden sumar valores significativos para los cálculos de peso molecular de moléculas grandes. Las masas elementales medias utilizadas por defecto en la aplicación de software se muestran en la Tabla Suplementaria 1. Para entornos regulados como el campo de la investigación y el desarrollo (I&D) biofarmacéutico, es importante mantener masas moleculares consistentes porque los cambios en las masas pueden implicar cambios en la entidad molecular durante las presentaciones regulatorias. Para permitir la coherencia en el uso de masas elementales, se incluye un diccionario de masas elementales con la herramienta de software como un archivo de texto de valores separados por comas (csv): Element_Mass.csv (Archivo de codificación suplementario 1). Del mismo modo, se incluye una lista curada de composiciones de glicanos que se ven típicamente en mAbs: Glycan.csv (Supplemental Coding File 2). Ambos archivos se guardan en la misma ubicación de carpeta que una aplicación ejecutable y pueden ser modificados por el usuario para usar una lista de masa elemental específica o una biblioteca de glicanos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg"> Figura 1: Interfaz gráfica de usuario para la aplicación mAbScale. El módulo GUI permite al usuario especificar la entrada para el cálculo de masa. El usuario introduce secuencias de aminoácidos de una sola letra para las cadenas de anticuerpos ligeros y pesados. Las modificaciones comunes para la ciclación del terminal N de cadena pesada y el recorte de lisina del terminal C se incluyen como casillas de verificación. Las fórmulas químicas/composiciones elementales se pueden sumar/restar a través del cuadro de texto respectivo de Chem Mod . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Modular system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody-drug conjugate (ADC)</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Proprietory molecule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEH 200 SEC column&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>176003904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bispecific mAb</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Proprietory molecule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Byos</td>
			<td>Protein Metrics, Cupertino, CA</td>
			<td>https://proteinmetrics.com/byos/ 
			Version 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW</td>
			<td>GPMAW</td>
			<td>http://www.gpmaw.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb standard&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>186009125</td>
			<td>Waters Humanized mAb Mass Check Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAbScale</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>Apache License, Version 2.0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Modular system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open-source framework for mass calculation of antibody-based therapeutic molecules

Las masas bioterapéuticas son un medio para verificar la identidad y la integridad estructural. La espectrometría de masas (MS) de proteínas intactas o subunidades proteicas proporciona una herramienta analítica sencilla para las diferentes etapas del desarrollo biofarmacéutico. La identidad de la proteína se confirma cuando la masa experimental de la EM está dentro de un rango de error de masa predefinido de la masa teórica. Si bien existen varias herramientas computacionales para el cálculo de los pesos moleculares de proteínas y péptidos, no fueron diseñadas para su aplicación directa a entidades bioterapéuticas, tienen limitaciones de acceso debido a licencias pagas o requieren cargar secuencias de proteínas en servidores host. 
Hemos desarrollado una rutina modular de cálculo de masas que permite determinar fácilmente las masas medias o monoisotópicas y las composiciones elementales de las glicoproteínas terapéuticas, incluidos los anticuerpos monoclonales (mAb), los anticuerpos biespecíficos (bsAb) y los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). La naturaleza modular de este marco de cálculo basado en Python permitirá la extensión de esta plataforma a otras modalidades como vacunas, proteínas de fusión y oligonucleótidos en el futuro, y este marco también podría ser útil para la interrogación de datos de espectrometría de masas de arriba hacia abajo. Al crear una aplicación de escritorio independiente de código abierto con una interfaz gráfica de usuario (GUI), esperamos superar las restricciones de uso en entornos donde la información propietaria no se puede cargar en herramientas basadas en la web. En este artículo se describen los algoritmos y la aplicación de esta herramienta, mAbScale, a diferentes modalidades terapéuticas basadas en anticuerpos.

Over the past two decades, biotherapeutics have evolved to become a mainstay of the modern pharmaceutical industry. The SARS-CoV2 pandemic and other life-threatening conditions have further increased the need for the faster and broader development of biopharmaceutical molecules1,2,3.
The biotherapeutic molecular weight is critical for the identification of the molecule, in combination with other analytical assays. The intact and reduced subunit masses are used throughout the discovery and development lifecycles as part of control strategies aimed at maintaining the quality, as described in the QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Analytical development in the biopharmaceutical industry relies heavily on mass measurements for intact mass analysis and deep characterization using peptide mapping or multi-attribute method (MAM) monitoring. At the center of these techniques utilizing modern mass spectrometry (MS) platforms is the ability to provide high-resolution accurate mass (HR/AM) measurements. Most HR/AM instruments yield mass accuracies in the range of 0.5-5 ppm, which scale with the mass range. The ability to measure masses accurately for intact large molecules enables the quick and confident identification of large-molecule therapeutics. As isotopic resolution cannot be attained using typical experimental conditions for large molecules (&#62;10 kDa), average masses must be calculated for comparison and identification5,6.
A typical intact or subunit protein mass spectrum represents the overall proteoform profile, which contains composite information on the various molecular forms resulting from post-translational modifications (PTM) and any primary structure differences, such as clips or sequence variants. The relatively easy and high-throughput nature of these measurements make them attractive for characterization and as in-process monitoring controls7,8. Data analysis for these experiments usually requires the user to define the search space for molecular forms (range of PTMs or other molecular forms). For glycosylated proteins, this search space is largely driven by glycoform heterogeneity. Combinations of multiple PTMs, disulfide bond configurations, and other variations along the primary structure make calculating all the possible molecular forms a tedious task. Therefore, the manual calculation of the possible molecular forms is a time and resource-consuming process with a high potential for human error.
Here, we present a mass calculation tool that was developed considering the most important features of biotherapeutic molecules, such as mAbs, bsAbs, ADCs, etc. The tool allows the easy incorporation of search-space variables for the consistent calculation of masses and elemental compositions. The modular nature of this tool will enable it to be further developed and applied to mass calculation and mass matching for other modalities.
The GUI module allows the user to specify the input for the mass calculation, as shown in Figure 1; specifically, the user enters single-letter amino acid sequences for light and heavy antibody chains. Common modifications for heavy-chain N-terminal cyclization and C-terminal lysine clipping are included as check boxes. Further, the chemical formula/elemental composition can be added/subtracted from these protein chains through the respective Chem Mod text box. This allows the user the flexibility to add an elemental composition that includes multiple post-translational modifications or a small-molecule payload in the case of an ADC. As most therapeutic mAbs are engineered to remove the glycosylation sites in the light chain, glycosylation in the light chain is left optional and can be specified using a check box on the GUI.
A typical variation on intact mass analysis for antibodies is a reduced subunit mass analysis, where the light chain is detached from the heavy chain by reducing the interchain disulfide bonds. Depending on the strength of the reducing agent used, the intrachain disulfide bonds may or may not be cleaved. The users have the flexibility of entering the total number of disulfide bonds depending on the IgG subtype or in case of a cysteine-conjugated ADC9.
The application calculates masses in a bottom-up manner, in which the elemental compositions are first calculated for the individual heavy chains and light chains. Next, heavy chain (HC) N-terminal cyclization Lys-clipping is accounted for by adjusting the calculated elemental compositions. Any specified chemical modifications are then applied to the heavy and/or light chains. Depending on the type of analysis and the disulfide-bond patterns specified by the user, the number of hydrogens is adjusted for the two polypeptide chains. The glycosylated HC and light chain (LC) (optional) masses are calculated based on the user&#39;s input. Finally, multiple HC and LC masses are combined, and the disulfide bond numbers are automatically updated for the intact mass calculation.
With larger molecules such as intact proteins, monoisotopic masses cannot be measured due to the additive mass defect when using mass spectrometers with typical resolving power. Instead, nominal or average masses are measured or reported5,10,11,12,13. The average elemental masses can vary based on the source used for the curated masses14,15. While the differences in elemental masses may be small, they can add up to significant values for large-molecule molecular weight calculations. The average elemental masses used by default in the software application are shown in Supplementary Table 1. For regulated environments like the biopharmaceutical research and development (R&#38;D) field, it is important to maintain consistent molecular masses because changes in masses may imply changes to the molecular entity during regulatory filings. To enable consistency in the use of elemental masses, a dictionary of elemental masses is included with the software tool as a comma-separated value (csv) text file: Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). Similarly, a curated list of glycan compositions typically seen on mAbs is included: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Both files are saved in the same folder location as an executable application and can be modified by the user to use a specific elemental mass list or glycan library.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg" /> 
Figure 1: GUI interface for the mAbScale application. The GUI module allows the user to specify the input for the mass calculation. The user enters single-letter amino acid sequences for the light and heavy antibody chains. Common modifications for the heavy-chain N-terminal cyclization and C-terminal lysine clipping are included as check boxes. Chemical formulas/elemental compositions can be added/subtracted through the respective Chem Mod text box. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor destacado: Avance en el cálculo de masas bioterapéuticas mediante la introducción de mAbScale, una aplicación de escritorio basada en Python

Un marco de código abierto para el cálculo masivo de moléculas terapéuticas basadas en anticuerpos

The challenge with accurate mass calculation for large protein molecules is the mass defect associated with the measurement. As a result, only average masses can be measured. Minor elemental mass differences may accumulate causing significant discrepancies in large paratherapeutic molecules like monoclonal antibodies.Our tool explicitly addresses the challenge in the consistent mass calculation for antibody-based therapeutics, such as MAPs, bispecifics, and antibody drug conjugates. Researchers in the commercial biopharmaceutical development space have to rely on manual calculation or tools that don't depend on communication with external servers due to the involvement of proprietary information. Existing tools either require a license or are not built considering the specific needs of biopharmaceutical development.MapScale offers a user-friendly interface and adaptable open source framework for users and developers. It supports maintaining multiple versions of elemental masses and modification lists, and allows list sharing to maintain consistency in calculations. The code can be shared on an enterprise level using internal servers or cloud-based deployment with controlled access to protect proprietary information.

Se seleccionó una variedad de anticuerpos monoclonales para representar diferentes tipos de anticuerpos monoclonales. Se seleccionó un estándar de AcM disponible comercialmente para representar un AcM convencional con cadenas pesadas idénticas, cadenas ligeras idénticas y un sitio de glicosilación ligado a N en la región Fc. También se eligió un AcM con una glicosilación Nligada a N de cadena ligera adicional, un AcM biespecífico y un AcM conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) para ampliar el uso de la aplicació...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Biotherapeutic Mass Calculation by Introducing mAbScale, a Python-Based Desktop Application at JoVE.com

En este artículo se describe el uso de una aplicación de software, mAbScale, para el cálculo de masas para terapias con proteínas basadas en anticuerpos monoclonales.

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides ...

El desafío con el cálculo preciso de la masa para moléculas de proteína grandes es el defecto de masa asociado con la medición. Como resultado, solo se pueden medir las masas medias. Las diferencias menores de masa elemental pueden acumularse causando discrepancias significativas en moléculas paraterapéuticas grandes como los anticuerpos monoclonales.Nuestra herramienta aborda explícitamente el desafío en el cálculo de masa consistente para terapias basadas en anticuerpos, como MAP, biespecíficos y conjugados anticuerpo-fármaco. Los investigadores en el espacio de desarrollo biofarmacéutico comercial tienen que confiar en el cálculo manual o en herramientas que no dependen de la comunicación con servidores externos debido a la participación de información patentada. Las herramientas existentes requieren una licencia o no se construyen teniendo en cuenta las necesidades específicas del desarrollo biofarmacéutico.MapScale ofrece una interfaz fácil de usar y un marco de código abierto adaptable para usuarios y desarrolladores. Admite el mantenimiento de múltiples versiones de masas elementales y listas de modificación, y permite compartir listas para mantener la coherencia en los cálculos. El código se puede compartir a nivel empresarial mediante servidores internos o una implementación basada en la nube con acceso controlado para proteger la información patentada.

an-open-source-framework-for-mass-calculation-antibody-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Open-Source Framework for Mass Calculation of Antibody-Based Therapeutic Molecules

1.2K vistas.  GlaxoSmithKline. El desafío con el cálculo preciso de la masa para moléculas de proteína grandes es el defecto de masa asociado con la medición. Como resultado, solo se pueden medir las masas medias. Las diferencias menores de masa elemental pueden acumularse causando discrepancias significativas en moléculas paraterapéuticas grandes como los anticuerpos monoclonales.Nuestra herramienta aborda explícitamente el desafío en el cálculo de masa consistente para terapias basadas en anticuerpos, co...

Video: Autor destacado: Avance en el cálculo de masas bioterapéuticas mediante la introducción de mAbScale, una aplicación de escritorio basada en Python

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides an easy analytical tool for different stages of biopharmaceutical development. The protein's identity is confirmed when the experimental mass from MS is within a pre-defined mass error range of the theoretical mass. While several computational tools exist for the calculation of protein and peptide molecular weights, they either were not designed for direct application to biotherapeutic entities, have access limitations due to paid licenses, or require uploading protein sequences to host servers. 
We have developed a modular mass calculation routine that enables the easy determination of the average or monoisotopic masses and elemental compositions of therapeutic glycoproteins, including monoclonal antibodies (mAb), bispecific antibodies (bsAb), and antibody-drug conjugates (ADC). The modular nature of this Python-based calculation framework will allow the extension of this platform to other modalities such as vaccines, fusion proteins, and oligonucleotides in the future, and this framework could also be useful for the interrogation of top-down mass spectrometry data. By creating an open-source standalone desktop application with a graphical user interface (GUI), we hope to overcome the restrictions around use in environments where proprietary information cannot be uploaded to web-based tools. This article describes the algorithms and application of this tool, mAbScale, to different antibody-based therapeutic modalities.

This article describes the use of a software application, mAbScale, for the calculation of masses for monoclonal antibody-based protein therapeutics.

Investigación

Bioquímica

Running the mAbscale Application to Calculate the Masses of Monoclonal Antibody-Based Protein Therapeutics

To begin, open the software application by double clicking on the icon for an executable file. Enter the heavy chain and light chain sequences in the text boxes under the 1 column without any spaces. For bispecific antibodies, add additional heavy or light chains in the second set of text boxes under the 2 column.Leave these boxes blank for monoclonal antibodies with identical heavy chains and light chains. Check the end terminal cyclization and C terminal clipping check boxes if these heavy chain terminal variants are applicable. Add chemical modifications including linker and payload for antibody drug conjugates to the heavy and light chain chemical modification boxes using elemental compositions such as calcium chloride.These modifications will be added to the respective protein subunit or chain. Specify the number of disulfide bonds in the protein molecules in the text box marked total number of disulfides. Enter the number of unreduced heavy chain disulfide bonds into the unreduced heavy chain disulfides text box and the number of unreduced light chain disulfide bonds into the unreduced light chain disulfides text box depending on the extent of reduction.If glycosylation is present on the monoclonal antibodies light chain, check the light chain is glycosylated check box. Click on the Browse button to select an output folder for the output folder text box and enter the output file name without a file extension into the Excel file no extension text box. Then click on the Submit button.A mass calculation report created message will appear on the screen and the output file can be found in the user designated folder. The app will close automatically. The chemical compositions, calculated masses, measured masses and mass errors of various monoclonal antibodies are summarized in this table.A commercially available monoclonal antibody standard was selected to represent a conventional monoclonal antibody with identical heavy chains, identical light chains, and one N-linked glycosylation site in the FC region. A monoclonal antibody with an additional light chain N-linked glycosylation, a bispecific monoclonal antibody, and an antibody drug conjugate monoclonal antibody were also chosen to widen the application usage. The small mass errors between the calculated masses and measured masses were within the normal mass error acceptance criteria, suggesting that the calculated masses were accurate.