A los autores les gustaría reconocer el linaje de información y tutoría que ha influido/evolucionado estas técnicas a lo largo de los años. El Dr. Hamilton-Brehm, como ex estudiante de posgrado, postdoctorado y profesor actual, tiene una deuda de gratitud con aquellos que se tomaron el tiempo para enseñar técnicas anaeróbicas: el Dr. Mike Adams, el Dr. Gerti Schut, el Dr. Jim Elkins, el Dr. Mircea Podar, el Dr. Duane Moser y el Dr. Brian Hedlund. The Nature Conservancy y American Rivers apoyaron este trabajo a través de las subvenciones G21-026-CON-P y AR-CE21GOS373, respectivamente. Las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este documento pertenecen a los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de The Nature Conservancy o American Rivers. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto de Energía Avanzada de SIU, que agradece la financiación otorgada a través de la Junta de Recursos Energéticos Avanzados. La NGS fue realizada por LC Sciences.

Método anaeróbico simulado in situ para el cultivo de microbios ambientales

<ol>
	<li>Staley, J. T., Konopka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+in+situ+activities+of+nonphotosynthetic+microorganisms+in+aquatic+and+terrestrial+habitats.">Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats.</a> Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).</li><li>Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetically+novel+uncultured+microbial+cells+dominate+earth+microbiomes.">Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes.</a> MSystems. 3 (5), e00055 (2018).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Marcy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+biological+&amp;#34;dark+matter&amp;#34;+with+single-cell+genetic+analysis+of+rare+and+uncultivated+tm7+microbes+from+the+human+mouth.">Dissecting biological &amp;#34;dark matter&amp;#34; with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).</li><li>Giovannoni, S., Stingl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+culturing+bacterioplankton+in+the'omics'+age.">The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).</li><li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+unculturable+bacteria.">Growing unculturable bacteria.</a> J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li><li>Dedysh, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+uncultured+bacteria+from+northern+wetlands:+Knowledge+gained+and+remaining+gaps.">Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps.</a> Front. Microbiol. 2, 184 (2011).</li><li>Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating&amp;#34;+uncultivable&amp;#34;+microorganisms+in+pure+culture+in+a+simulated+natural+environment.">Isolating&amp;#34; uncultivable&amp;#34; microorganisms in pure culture in a simulated natural environment.</a> Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).</li><li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics.">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), e00012 (2011).</li><li>Tyson, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-directed+isolation+of+the+key+nitrogen+fixer+Leptospirillum+ferrodiazotrophum+sp.+nov.+from+an+acidophilic+microbial+community.">Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).</li><li>Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogens:+Reevaluation+of+a+unique+biological+group.">Methanogens: Reevaluation of a unique biological group.</a> Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).</li><li>Merino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsurface+microbial+communities+as+a+tool+for+characterizing+regional-scale+groundwater+flow.">Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow.</a> Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).</li><li>. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791 Available from: <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf</a> (2013)</li><li>. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512 Available from: <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf</a> (2018)</li><li>Mullin, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+in+situ+mineral+colonization+by+microorganisms+in+a~+60+c+deep+continental+subsurface+aquifer.">Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer.</a> Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).</li><li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+miseq+illumina+sequencing+platform.">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li><li>Miller, T. L., Wolin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serum+bottle+modification+of+the+hungate+technique+for+cultivating+obligate+anaerobes.">A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes.</a> Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).</li><li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoanaerosceptrum+fracticalcis+gen.+nov.+sp.+nov.,+a+novel+fumarate-fermenting+microorganism+from+a+deep+fractured+carbonate+aquifer+of+the+us+great+basin.">Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin.</a> Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).</li><li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caldicellulosiruptor+obsidiansis+sp.+nov.,+an+anaerobic,+extremely+thermophilic,+cellulolytic+bacterium+isolated+from+obsidian+pool,+yellowstone+national+park.">Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).</li><li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodesulfobacterium+geofontis+sp.+nov.,+a+hyperthermophilic,+sulfate-reducing+bacterium+isolated+from+obsidian+pool,+yellowstone+national+park.">Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).</li><li>Twigg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+aspects+of+resazurin.">Oxidation-reduction aspects of resazurin.</a> Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

La sección de producción media de este protocolo (sección 1) debe su estructura a la técnica de Hungate modificada de Miller y Wolin17, que ha sido ampliamente utilizada desde su publicación. La practicidad de este protocolo ampliado proviene de su naturaleza descriptiva y de su emparejamiento con la adquisición in situ de microorganismos. Se han utilizado frascos de cultivo que contienen medios simulados e informados sobre el medio ambiente para cultivar con éxito los siguientes a...

La mayoría de los microorganismos permanecen sin cultivar; Esto se ve respaldado por la gran disparidad entre las células observadas a través de la microscopía contrastada con los pocos microorganismos cultivados con éxito utilizando placas de agar. Staley y Konopka llamaron a esta disparidad la "Gran Anomalía del Conteo de Placas"1. La diversidad estimada no contabilizada está respaldada por datos metagenómicos y metatranscriptómicos que muestran muchos géneros nuevos distribuidos en curvas de abundancia de rangos de varios ambientes diferentes2. Los microorganismos que se han observado (generalmente mediante secuenciación aleatoria de una comunidad microbiana) pero que no han sido cultivados se han denominado "materia oscura microbiana"3,4.
En la era de las -ómicas, el cultivo de microorganismos sigue siendo imperativo para evaluar completamente los datos genómicos y verificar la función/fenotipo de los genes presentes. La secuenciación de microorganismos cultivados sigue siendo la única forma de obtener genomas completos con confianza hasta que tecnologías como la metagenómica de escopeta y los genomas ensamblados con metagenomas del medio ambiente se vuelvan admisiblementeinfalibles. Las evaluaciones genómicas junto con los microorganismos cultivados proporcionan fuertes inferencias para comprender la "materia oscura microbiana". Muchos miembros de la "materia oscura microbiana" realizan funciones cruciales que afectan el ciclo de nutrientes y otros elementos y la producción de productos naturales valiosos, apoyan los sistemas ecológicos y realizan servicios ecológicos. Desde el punto de vista médico, alrededor de la mitad de todos los productos farmacéuticos comercializados actualmente son productos y derivados de productos de bacterias, y se sospecha que el perfil de especies no cultivadas revelará los antibióticos del futuro. Para acceder a esta mayoría inculta, se debe aumentar una variedad de metodologías de cultivo6. Entre los miembros de la "materia oscura microbiana", los microorganismos oligotróficos anaeróbicos están en gran medida subestimados y probablemente contienen vías bioquímicas ecológica e industrialmentevaliosas, lo que los convierte en objetivos importantes de cultivo. Sin embargo, los microorganismos oligotróficos anaeróbicos son más difíciles de cultivar que sus homólogos aeróbicos y copiotróficos debido a los tiempos de incubación más largos que a menudo se requieren, las condiciones exigentes (por ejemplo, temperaturas in vitro particulares no estándar) y el uso de recetas de medios especializados.
Las técnicas actuales en desarrollo para cultivar miembros de la "materia oscura microbiana", incluidos nuevos microorganismos oligotróficos anaeróbicos, han mejorado en gran medida nuestra comprensión y han aumentado la representación de estos microorganismos dentro del árbol filogenético. Las técnicas actuales que utilizan medios informados para el cultivo de microorganismos novedosos (es decir, medios que se derivan utilizando el conocimiento de los microorganismos de interés) pueden dividirse en tres métodos distintos. El primero de los métodos consiste en la eliminación directa de una sección discreta del medio ambiente para transferirla a una cámara de crecimiento in vitro que ya contiene los microorganismos de interés dentro de una membrana. La sección discreta (por ejemplo, el agua de mar) actúa para proporcionar a los microorganismos de interés el hábitat geoquímico que utilizan in situ, mientras que la membrana detiene el movimiento de las células a través de él (las células de interés permanecerán dentro; las células extrañas que llegaron con la sección discreta permanecerán fuera). Al incluir compuestos naturalmente disponibles para atacar microorganismos en su hábitat natural, dichos microorganismos pueden cultivarse8. El segundo método utiliza la metatranscriptómica o genómica para dilucidar las capacidades metabólicas, proporcionando pistas sobre parámetros de cultivo estrechos para un diseño de medio dirigido. Este enfoque proporciona un perfil ecofisiológico que se puede utilizar para orientar el enriquecimiento de tipos específicos de microorganismos fuera de un medio ambiente. Las provisiones del medio se atienden a los genes identificados presentes que se presume que apoyan a los microorganismos objetivo para reducir la diversidad de enriquecimiento,9,10. Una advertencia es que la información genómica no infiere directamente la expresión de los genes, mientras que la información transcriptómica sí lo hace.
El tercer método engloba los medios de comunicación informados sobre el medio ambiente y los medios de comunicación, a diferencia del primer método, que no simula los medios de comunicación, sino que utiliza el medio ambiente directamente como fuente de medios. Este tercer método requiere el reconocimiento ambiental de la geoquímica de un sitio de campo que contiene microorganismos de interés. Con este conocimiento, se identifican los componentes primarios y los parámetros físicos para producir un medio simulado ambientalmente informado. Luego, el medio recibe una infusión directa de sedimento o líquido que contiene microorganismos del medio ambiente en el medio. Este método es de particular valor en los casos en que el microbiólogo de cultivo no tiene acceso a cantidades suficientes de ambiente de origen (como se necesita para el primer método) ni a datos metatranscriptómicos o genómicos apropiados (como se necesita para el segundo).
El siguiente protocolo es un ejemplo del tercer método; Se basa en entornos de interés y tiene como objetivo simularlos. En el protocolo se presentan en paralelo tres recetas ingenuas dirigidas a diferentes cultivos anaeróbicos de microorganismos adquiridos en el campo. Los tres cultivos representados son los cultivos mixtos que se originan en el suelo (en adelante, el cultivo mixto del suelo), los cultivos mixtos que se originan en el interior de un pozo (en adelante, el cultivo mixto del pozo) y un metanógeno aislado que se origina en el interior de un pozo (en adelante, metanógeno aislado del pozo). Las identidades compuestas y las cantidades en las recetas de los medios de comunicación compartidas aquí pretenden ser una guía inicial; Son capaces y se les anima a personalizarse según el entorno del lector y los microorganismos de interés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L borosillicate bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with slip tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL culture bottle</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mm hand crimper</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL borosilicate bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum seal</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula, 31.5 cm length</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula, 6 cm length</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corer</td>
			<td>Giddings Machine Company&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Assembled from company parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas manifold</td>
			<td>Swagelok</td>
			<td></td>
			<td>Assembled from many different parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lighter</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper (for GL45 bottles)</td>
			<td>Glasgeratebau OCHS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper (for culture bottles)</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace minerals</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamins</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor-specific Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 rubber stopper</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#7 rubber stopper</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe with luer lock tip</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; hose barb ball valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe with luer lock tip</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L borosilicate bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/16&#34; - 1/4&#34; hose barb adapter fitting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe with luer lock tip</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 L borosillicate carboy</td>
			<td>Allen Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled hose connector for GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7623-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balloon</td>
			<td>Party City</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate bioreactor</td>
			<td>Allen Scientific Glass</td>
			<td></td>
			<td>Custom made upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer lock adapter coupler</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7621-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL18 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7621-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL45 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7625-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7625-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring stand</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring stand chain clamp</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring stand clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing; 1/4&#34; id, 1/2&#34; od</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>55YG13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing; 3/16&#34; id, 3/8&#34; od</td>
			<td>Grainger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight hose connector for GL14 open top cap</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7623-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcock</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-way stopcock</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low flow variable flow mini-pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White rubber septum for 13-18 mm od tubes</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>9096-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip tie</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a set of in situ informed simulated medium formats for culturing environmentally acquired anaerobic microorganisms

La investigación dependiente del cultivo de microorganismos anaerobios se basa en la competencia metodológica. Estos métodos deben crear y mantener condiciones de crecimiento adecuadas (por ejemplo, pH y fuentes de carbono) para los microorganismos anaeróbicos, al tiempo que permiten extraer muestras sin comprometer el entorno artificial. Con este fin, los métodos que se basan en un entorno in situ y lo simulan pueden ser de gran ayuda en el cultivo de microorganismos de ese entorno. Aquí, describimos un método anaeróbico in situ informado y simulado para el cultivo de microorganismos terrestres de superficie y subsuelo, enfatizando la recolección anaeróbica de muestras con una perturbación mínima. Este protocolo detalla la producción de un medio líquido anaeróbico personalizable y la adquisición ambiental y el crecimiento in vitro de microorganismos anaeróbicos. El protocolo también cubre los componentes críticos de un biorreactor anaeróbico utilizado para simulaciones ambientales de sedimentos y medios líquidos anaeróbicos para cultivos adquiridos ambientalmente. Hemos incluido datos preliminares de secuenciación de nueva generación de un microbioma mantenido durante la vida útil de un biorreactor en el que el cultivo activo se ajustó dinámicamente en respuesta a una fuente de carbono experimental.

Most microorganisms remain uncultured; this is supported by the great disparity between cells observed through microscopy contrasted by the few microorganisms successfully cultured using agar plates. Staley and Konopka named this disparity the &#34;Great Plate Count Anomaly&#34;1. The estimated unaccounted diversity is supported by metagenomic and metatranscriptomic data showing many novel genera distributed in rank abundance curves from several different environments2. Microorganisms that have been observed (generally by random shotgun sequencing of a microbial community) but have not been cultured have been referred to as &#34;microbial dark matter&#34;3,4.
In the age of -omics, culturing microorganisms remains imperative to fully evaluate genomic data and verify the function/phenotype of genes present. Sequencing cultured microorganisms is still the only way to confidently obtain complete genomes until technologies such as shotgun metagenomics and metagenome-assembled genomes from the environment become admissibly infallible5. Genomic evaluations coupled with cultured microorganisms provide strong inferences for understanding &#34;microbial dark matter.&#34; Many members of the &#34;microbial dark matter&#34; perform crucial functions that impact the cycling of nutrients and other elements and the production of valuable natural products, support ecological systems, and perform ecological services. From the medical perspective, about half of all currently marketed pharmaceuticals are products and derivatives of products from bacteria, and profiling uncultured species is suspected to reveal the antibiotics of the future. To gain access to this uncultured majority, a variety of culturing methodologies must be increased6. Among the members of the &#34;microbial dark matter,&#34; anaerobic oligotrophic microorganisms are largely underreported and likely hold ecologically and industrially valuable biochemical pathways7, making them important targets of culturing. However, anaerobic oligotrophic microorganisms are more difficult to culture than their aerobic and copiotrophic counterparts due to often-required longer incubation times, fastidious conditions (e.g., particular non-standard in vitro temperatures), and the use of specialized media recipes.
Current developing techniques to culture members of the &#34;microbial dark matter,&#34; including novel anaerobic oligotrophic microorganisms, have greatly improved our understanding and increased the representation of these microorganisms within the phylogenetic tree. Current techniques using informed media for culturing novel microorganisms (i.e., media which is derived using knowledge of the microorganism/s of interest) can be separated into three distinct methods. The first of the methods entails the direct removal of a discrete section of the environment for transfer into an in vitro growth chamber that already contains the microorganisms of interest within a membrane. The discrete section (e.g., seawater) acts to provide the microorganisms of interest with the geochemical habitat they use in situ, while the&#160;membrane arrests the movement of cells across (cells of interest will remain within; extraneous cells that arrived with the discrete section will remain without). By including compounds naturally available to target microorganisms in their natural habitat, such microorganisms can be cultured8. The second method utilizes metatranscriptomics or genomics to elucidate metabolic capabilities, providing clues to narrow culturing parameters for a targeted medium design. This approach provides an eco-physiological profile that can be used to target the enrichment of specific types of microorganisms out of an environment. The medium&#39;s provisions are catered to the identified genes present that are presumed to support the targeted microorganism(s) to reduce enrichment diversity,9,10. One caveat is that genomic information does not directly infer the expression of genes, while transcriptomic information does.
The third method encompasses environmentally informed and simulated media, distinct from the first method, which does not simulate the media but rather uses the environment directly as a source of media. This third method requires environmental reconnaissance of the geochemistry of a field site containing microorganisms of interest. With this knowledge, primary components and physical parameters are identified to produce an environmentally informed simulated medium. The medium then receives a direct infusion of microorganism-containing sediment or liquid from the environment into the medium. This method is of particular value in cases where the culturing microbiologist does not have access to sufficient quantities of source environment (as needed for the first method) nor appropriate metatranscriptomic or genomic data (as needed for the second).
The following protocol is an example of the third method; it is informed by and aims to simulate environments of interest. Three na&#239;ve media recipes targeting different anaerobic microorganism cultures acquired in the field are presented in parallel within the protocol. The three cultures represented are mixed cultures originating from soil (hereafter, soil mixed culture), mixed cultures originating from within a borehole (hereafter, borehole mixed culture), and an isolated methanogen originating from within a borehole (hereafter, borehole isolated methanogen). The compound identities and amounts in the media recipes shared here are meant as a beginning guide; they are able and encouraged to be customized to the reader&#39;s environment and microorganisms of interest.

Autor destacado: Desentrañando los misterios de los microorganismos anaeróbicos terrestres en entornos inexplorados mediante el cultivo in situ

Un conjunto de formatos de medios simulados informados in situ para el cultivo de microorganismos anaeróbicos adquiridos en el medio ambiente

Our research focuses on terrestrial surface and subsurface microorganisms, culturing them and investigating their genomes and phenotypes. Of particular focus are microorganisms in environments that are not well understood, like those in the deep subsurface and in certain wetlands. Most of the microorganisms we culture are anaerobic, which means the culturing process generally requires more time and attention than processes for more commonly-used aerobic microorganisms.We hope the audiovisual presentation of anaerobic medium preparation will help researchers new to the technique learn it relatively quickly and easily. This medium preparation is based on the modified Hungate technique of Miller and Wolin. Culturing fastidious microbes is tedious and problematic.Having more tools to grow them is very welcome to the scientific community. Future research in general will be similar to our current research of understudied terrestrial microorganisms. There are still many new microbes to discover and study.

Aquí mostramos los resultados de un estudio de biorreactor utilizando un método de preparación de medio de cultivo mixto de pozo y un método de configuración de biorreactor como se describe en este documento. El medio de cultivo mixto de pozo fue modificado para contener como fuente de carbono una lechada de mazorcas de maíz procesada por Disolución Hidrotermal Oxidativa (OHD)13,14. El medio de cultivo mixto de pozo modificado se bombeó al biorreactor dur...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Unraveling the Mysteries of Terrestrial Anaerobic Microorganisms in Uncharted Environments by In Situ Culturing at JoVE.com

El objetivo de este artículo es detallar las mejores prácticas para la fabricación de medios para microorganismos anaeróbicos exigentes adquiridos de un medio ambiente. Estos métodos ayudan a manejar los cultivos anaeróbicos y se pueden aplicar para apoyar el crecimiento de microorganismos no cultivados elusivos, la "materia oscura microbiana".

Culture-dependent research of anaerobic microorganisms rests upon methodological competence. These methods must create and maintain suitable growth ...

Nuestra investigación se centra en los microorganismos terrestres de superficie y subsuelo, cultivándolos e investigando sus genomas y fenotipos. De particular interés son los microorganismos en ambientes que no se conocen bien, como los del subsuelo profundo y los de ciertos humedales. La mayoría de los microorganismos que cultivamos son anaeróbicos, lo que significa que el proceso de cultivo generalmente requiere más tiempo y atención que los procesos para microorganismos aeróbicos más utilizados.Esperamos que la presentación audiovisual de la preparación anaeróbica del medio ayude a los investigadores nuevos en la técnica a aprenderla de forma relativamente rápida y sencilla. Esta preparación media se basa en la técnica Hungate modificada de Miller y Wolin. Cultivar microbios fastidiosos es tedioso y problemático.Tener más herramientas para cultivarlos es muy bienvenido por la comunidad científica. La investigación futura en general será similar a nuestra investigación actual de microorganismos terrestres poco estudiados. Todavía hay muchos microbios nuevos por descubrir y estudiar.

a-set-situ-informed-simulated-medium-formats-for-culturing

Research

JoVE Journal

Environment

A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms

428 vistas.  Southern Illinois University Carbondale. Nuestra investigación se centra en los microorganismos terrestres de superficie y subsuelo, cultivándolos e investigando sus genomas y fenotipos. De particular interés son los microorganismos en ambientes que no se conocen bien, como los del subsuelo profundo y los de ciertos humedales. La mayoría de los microorganismos que cultivamos son anaeróbicos, lo que significa que el proceso de cultivo generalmente requiere más tiempo y atención que los procesos para microorganismos aeróbicos ...

Video: Autor destacado: Desentrañando los misterios de los microorganismos anaeróbicos terrestres en entornos inexplorados mediante el cultivo in situ

Culture-dependent research of anaerobic microorganisms rests upon methodological competence. These methods must create and maintain suitable growth conditions (e.g., pH and carbon sources) for anaerobic microorganisms while also allowing samples to be extracted without compromising the artificial environment. To this end, methods that are informed by and simulate an in situ environment can be of great aid in culturing microorganisms from that environment. Here, we outline an in situ informed and simulated anaerobic method for culturing terrestrial surface and subsurface microorganisms, emphasizing anaerobic sample collection with minimal perturbation. This protocol details the production of a customizable anaerobic liquid medium, and the environmental&#160;acquisition and in vitro growth of anaerobic microorganisms. The protocol also covers critical components of an anaerobic bioreactor used for environmental simulations of sediment and anaerobic liquid media for environmentally acquired cultures. We have included preliminary Next Generation Sequencing data from a maintained microbiome over the lifespan of a bioreactor where the active culture dynamically adjusted in response to an experimental carbon source.

The focus of this paper is to detail best practices for making media for fastidious anaerobic microorganisms acquired from an environment. These methods help manage anaerobic cultures and can be applied to support the growth of elusive uncultured microorganisms, the "microbial dark matter."